Experimentelle Untersuchungen zur quarzinduzierten Sklerodermie

Stichwörter: Quarzinduzierte Sklerodermie, Endothelzellen, Monozyten, Fibroblasten
Vorausgehende Expositionen mit anorganischen Stäuben können bei empfänglichen Personen zur Ausbildung von Staublungen und auch von systemischen fibrotischen Erkrankungen wie der systemischen Sklerodermie (PSS) führen. Quarz induziert dosisabhängig mRNA- und Proteinexpression von ICAM 1 in mikrovaskulären dermalen Endothelzellen. Monozyten- oder Leukozytenpräparate sezernieren konzentrationsabhängig erhöhte Mengen von Interleukin-1a, IL-1ß und TNFa. Dermale Fibroblasten werden in der Monolayerkultur zu einer Induktion der interstitiellen Kollagenase stimuliert, was sich in einem zeitweilig reduzierten Kontraktionsvermögen von Kollagengelen äußert. Dagegen wird die Expression von Kollagen-I-(a1-)mRNA in quarzbehandelten Fibroblasten nach Kultur im Kollagengel verstärkt, was mit einer Reduktion der Synthese für die interstitielle Kollagenase I einhergeht. Somit kann Quarz trotz seiner chemisch inerten Eigenschaften eine Anzahl von für die PSS pathogenetisch relevanten Zelltypen in einer für die Pathophysiologie adäquaten Art und Weise stimulieren.
Key words: Silica-induced scleroderma, endothelium, monocytes, fibroblasts Individuals exposed to mineral dust can develop silicosis in combination with systemic fibrotic diseases such as progressive systemic sclerosis (PSS). Silica induces the mRNA and protein expression of ICAM 1 in microvascular
dermal endothelial cells in a dose-dependent fashion. Monocytes or mixed leucocyte preparations release elevated amounts of interleukins IL-1a, IL-1ß and TNFa after incubation with silica. Dermal fibroblasts are induced by silica to produce increased amounts of interstitial collagenase in monolayer cultures, whereas the ability of those cells to contract collagen gels is periodically decreased. In addition, the expression of collagen-I(a1-)mRNA from silica-treated fibroblasts cultured in gels was increased, with a parallel decrease in mRNA expression for interstitial collagenase I. Thus, despite its chemical inertia, silica is able to stimulate cells involved in the development of PSS in a way that is similar to pathophysiological mechanisms known from PSS.

Eine berufliche Quarzstaubexposition erhöht das Risiko, an einer systemischen Sklerodermie zu erkranken, um mehr als das Fünffache. Die quarzinduzierte Sklerodermie wurde innerhalb Deutschlands in Sachsen sowie international vor allem bei Bergarbeitern, welche unter schlechten Arbeitsschutzbedingungen beschäftigt waren, festgestellt. Eine Lungenbeteiligung in Form einer Silikose wurde oft beobachtet, ist aber nicht zwingend. In eigenen epidemiologischen Studien hatten wir unter 137 männlichen Sklerodermiepatienten 111 mit LangzeitQuarzstaubexposition gefunden, 57 davon mit Silikose. Von den pathophysiologischen Merkmalen her, wie Beteiligung der Kapillargefäße, dem Auftreten von Autoantikörpern, veränderten CD4/CD8-T-ZellVerhältnissen und der Ablagerung von Proteinen der extrazellulären Matrix ist die quarzinduzierte Sklerodermie nicht von der idiopathischen Sklerodermie zu unterscheiden (6). Da bei Patienten mit quarzinduzierter Sklerodermie Quarzkristalle ebenfalls in der Dermis nachgewiesen werden konnten (9, 11), stellten wir uns folgende Ausgangsfragen für die experimentellen Untersuchungen mit Quarz:
Besitzt die Quarzeinwirkung auf dermale Zellen eine Relevanz für die Pathogenese der quarzinduzierten Sklerodermie? Wirkt Quarz modulierend auf den Stoffwechsel und die Zell-Zell-Interaktionen dermaler Zellen und peripherer Blutzellen?
Material und Methoden
SiO2 (Charge: DQ12 vom Institut für Arbeitsmedizin, Universität Düsseldorf) mit einer Kristallgröße < 5 µm wurde für alle Untersuchungen genutzt. In den Untersuchungen mit Leukozyten und Monozyten wurde TiO2 als inerte Negativkontrolle genutzt. Folgende Antikörper wurden in den FACS-Analysen verwendet: anti-CD14, anti-CD31, anti-CD54, Kulturüberstand mit monoklonalem anti-Fibroblasten-Antikörper (4). Alle genutzten Enzyme und Biochemikalien entsprachen dem Reinheitsgrad für molekularbiologische Untersuchungen, soweit nicht anders dargestellt.
Kultur dermaler Fibroblasten
Humane dermale Fibroblasten wurden aus Hautbioptaten aus unserer Klinik durch Auswachsen in Dulbeccos Modified Eagle Medium gewonnen und nach bereits beschriebenen Standardmethoden kultiviert (1, 3). Diese Zellen wurden zwischen der dritten und achten Kulturpassage für die Untersuchungen eingesetzt.
Leukozyten/Monozyten
Die Präparation von Leukozyten erfolgte über eine Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation. Dafür wurde humanes EDTA-Blut mit dem gleichen Volumen PBS verdünnt. Ficoll PaqueET wurde anschließend vorsichtig mit dem Blut überschichtet und 20 Minuten bei 800 xg bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Interphasering wurde abgenommen und dreimal mit PBS gewaschen. Zur Präparation angereicherter Monozyten wurde eine kombinierte Reinigungsmethode mit Vorseparation über 6 Prozent (w:v) Dextran 550T und Nycoprep (p = 1,068 g x cm-3), Dichtezentrifugation wie in (3) beschrieben, genutzt. Reinheit und Ausbeute wurde durch spezifische a-Naphtylazetatesterase-Färbung oder Bestimmung der Zellzahl analysiert. Die Zellkultur erfolgte serumfrei über 24 bis 96 Stunden in RPMI 1640 mit verschiedenen Konzentrationen von SiO2 oder TiO2 als Kontrollsubstanz.
Humane dermale
mikrovaskuläre Endothelzellen
Die mikrovaskulären dermalen Endothelzellen und die dazugehörige EGM-MV Bulletkit wurden zur Herstellung des Kulturmediums nach Originalprotokoll genutzt. Zu den Versuchen mit Quarz wurde hydrokortisonfreies Medium eingesetzt. Zuzüglich wurde die Reinheit der Kulturen durch FACS-Analyse mit anti-CD31- Antikörpern als positive und mit dem fibroblastenspezifischen Antikörper AS02 (10) als negative Kontrolle überprüft. Die Zellen wurden zwischen den vierten und sechsten Passagen in mindestens drei parallelen Experimenten genutzt.
FACS-Analysen
Die Zellsuspension (zweimal 105 Zellen bei adhärent wachsenden Zellen nach dem Trypsinieren und Waschen mit PBS) wurde aliquotiert und mit 20 µl (200 µg/ml) Primärantikörper für eine Stunde bei 4° Celsius inkubiert. Anschließend wurde der ungebundene Antikörper mit PBS, 10 Prozent (v:v) Gelafusal gewaschen und mit 10 µl (200 µg/ml) FITC-markiertem Sekundärantikörper versetzt. Nach 45 Minuten Inkubationszeit wurden die Zellen zweimal mit PBS-Gelafusal gewaschen und an einem EPICS-II-Durchflußzytometer analysiert. In einem Parallelansatz wurde nach mechanischem Ablösen der Zellen überprüft, daß die Trypsin-Behandlung keinen Einfluß auf die Messung von zellständigem ICAM-1 hat.
Zytokinbestimmungen im Überstand von Zellkulturen
Freigesetzte Zytokine wurden in den serumfreien Überständen von quarzexponierten Leukozyten, Monozyten und mikrovaskulären Endothelzellen (sICAM-1) bestimmt. Hierzu wurden die Überstände von
1 x 107 Zellen vor der Bestimmung durch Zentrifugation (15 000 xg) von Zellen und Zellbruchstücken befreit und anschließend laut Herstellervorschrift eingesetzt. Folgende ELISA-Kits wurden genutzt: Interleukin-1b, Interleukin-1a: Quantikine (je 3,9250 pg/ml), TNFa (15,6-1 000 pg/ml). Die Bestimmung des löslichen ICAM-1 in Überständen quarzexponierter mikrovaskulärer Endothelzellen erfolgte mit Hilfe eines Parameter-ELISA (2,1-50 ng/ml).
Bestimmung von relativen
mRNA-Expressionsniveaus
Kultivierte Zellen wurden in der Kulturflasche mit PBS gewaschen und anschließend sofort mit Extraktionspuffer (µicro spin mRNA purification kit) lysiert. Die mRNA wurde nach Herstellervorschrift präpariert und photometrisch quantifiziert. Die RNA wurde wie beschrieben aufgetrennt und geblottet (1).
Wenn Fibroblasten in Kollagengelen kultiviert wurden (siehe 1), erfolgte die Präparation der Gesamt-RNA mit Hilfe von UltraspecTM. Die Gele wurden mit 0,5 ml UltraspecTM pro Gel für 10 Minuten auf Eis gelöst. Durch Zugabe von 0,1 Volumen Chloroform und Zentrifugation bei 3 000 xg wurden die Phasen separiert. Aus der wäßrigen Phase wurde die RNA mittels Fällung durch Zugabe von einem Volumen Isopropanol und Zentrifugation bei 12 000 xg für 10 Minuten isoliert. Das Pellet wurde mit 70 Prozent Ethanol gewaschen, getrocknet und in Wasser gelöst.
Zur Hybridisierung wurden folgende, mittels In-vitro-Transkription mit Digoxigenin markierte AntisenseSonden genutzt: Kollagen I (Klon Hf677, durch freundliche Überlassung von Prof. T. Krieg, Köln), ein
1,2 kb Eco RI-Pst I-Fragment der
cDNA für interstitielle Kollagenase I, eine über RT-PCR generierte cDNA-Sonde für den spezifischen Kollagenaseinhibitor TIMP-1 und ein in pBluescriptSK+ kloniertes PCR-Fragment humaner cDNA für GAPDH (2) oder eine b-Aktin-Sonde als mRNA-Mengenstandard. Die Hybridisierung und der Nachweis der Digoxygenin-markierten Hybride erfolgte wie kürzlich beschrieben (1, 2). Die Intensität der Signale wurde über das GAP-DH oder das b-Aktin-Signal normiert. In der statistischen Auswertung wurde der Mittelwert der Abweichungen der Daten vom Durchschnitt für einen Versuchswert angegeben.
Ergebnisse und Diskussion
Als erstes Zellkompartiment, welches sowohl bei der idiopathischen als auch bei der quarzinduzierten Sklerodermie involviert ist, untersuchten wir die mikrovaskulären Endothelzellen. In vivo wurde zum Beispiel von Gruschwitz und Koautoren eine Aktivierung der Endothelzellen mikrovaskulärer Kapillaren anhand erhöhter Expressionen von ICAM 1 (CD54) nachgewiesen (5). Zudem konnte um diese Gefäße herum ein entzündliches Infiltrat gezeigt werden. Weiterhin ist bei der systemischen Sklerodermie ebenfalls perivaskulär eine erhöhte Expression von transforming growth factor b (TGFb) nachweisbar, die mit der gesteigerten Expression von mRNA für Kollagen (a1)I co-lokalisiert ist (7).
In unseren Versuchen konnten wir an Kulturen von mikrovaskulären dermalen Endothelzellen (HDMEC) zeigen, daß Quarz dosisabhängig die mRNA- und Proteinsynthese für ICAM 1 steigert (Tabelle). Weiterhin wird in vitro die Expression der mRNA für die interstitielle Kollagenase I induziert und durch diese Zellen vermehrt IL-6 an das Medium abgegeben (2).
Die Induktion von ICAM 1 auf der Oberfläche von Endothelzellen kann in vivo eine verstärkte Adhäsion von peripheren Blutzellen an die Gefäßwand und eine nachfolgende Auswanderung aus dem Gefäß in das umliegende Gewebe begünstigen. Aus diesen Gründen und der Tatsache heraus, daß Monozyten/Makrophagen bei der quarzinduzierten interstititiellen Lungenfibrose eine primäre Rolle spielen, untersuchten wir die Einflüsse von Quarz auf mononukleäre Zellen aus peripherem Spenderblut. Hierbei konnten wir folgende Merkmale der Zellaktivierung nachweisen:
¿ Quarz induziert dosisabhängig die Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen, wie Tumor-Nekrose-Faktor a (TNFa), Interleukin-1a und -1b sowie Interleukin-6 durch periphere mononukleäre Blutzellen (Grafik 1).
À Die Kinetik der Aktivierung hängt dabei von der Zusammensetzung der untersuchten Zellfraktion ab. So zeigten gemischte Leukozytenpräparate erst nach 48 Stunden eine Induktion der Zytokinfreisetzung, die jedoch auch nach zehntägiger Kultur noch nachweisbar war. In gereinigten Monozytenfraktionen war die quarzspezifische Induktion dagegen bereits nach 24 Stunden nachweisbar (Daten nicht gezeigt).
Á Bei diesen Versuchen sind keine toxischen Effekte des Quarz festzustellen. Nach sechstägiger Kultur wurden auch in der höchsten Konzentration von 250 µg Quarz/ml Medium noch über 80 Prozent lebende Zellen bestimmt (3, 4).
Dermale Fibroblasten sind die Hauptproduzenten der extrazellulären Matrix (ECM) und somit für das phänotypische Erscheinungsbild der Sklerodermie verantwortlich. Die Dysregulation der Kollagensynthese wird in vivo mit der erhöhten Expression von TGFb, der verringerten Expression von interstitieller Kollagenase I und der erhöhten Kollagensynthese in Verbindung gebracht. Allerdings sind die Fibroblasten nicht homogen, und aus den verschiedenen Schichten der Dermis können Fibroblasten mit unterschiedlichen Syntheseraten für Kollagene und auch für die interstitielle Kollagenase isoliert werden.
In unseren Untersuchungen konzentrierten wir uns auf den Einfluß von Quarz auf die Expression von Proteinen der ECM durch Fibroblasten in Abhängigkeit von den gewählten Kulturbedingungen. Werden dermale Fibroblasten im Monolayer kultiviert, kommt es durch Quarz nicht zu einer Veränderung der Expression von Kollagen I und III, wohl aber zu einer Induktion der mRNA für die interstitielle Kollagenase I (Abbildung 1) (1). Dermale Fibroblasten sind in vivo jedoch dreidimensional von einer extrazellulären Matrix umgeben und kommunizieren zum Beispiel über Adhäsionsmoleküle mit dieser. Es ist bekannt, daß die Synthese von Proteinen der extrazellulären Matrix von den Kulturbedingungen abhängig ist und daß zum Beispiel die Kollagensynthese bei Kultivierung im dreidimensionalen Kollagengel drastisch herabreguliert wird (8).
In dieser Arbeit zeigen wir, daß dermale Fibroblasten, welche mit Quarz vorinkubiert waren, in Kollagengelen verstärkt Kollagen I exprimierten und die Kollagenase-I-Expression im Einklang mit dem spezifischen Inhibitor, TIMP-1, reduziert wird (Abbildung 1).
Phänotypisch kann man dabei ein reduziertes Vermögen der Fibroblasten zur Kontraktion von Kollagengelen nachweisen (1). Die Fähigkeit zur Gelkontraktion nahm dabei mit steigender Quarzkonzentration bei gleicher eingesetzter Zellzahl ab. Mikroskopische Untersuchungen zeigten eine deutliche Reduktion der Zell-ZellInteraktionen nach Preinkubation der Zellen mit Quarz. Da alle Kollagengele nach 96 Stunden den gleichen Enddurchmesser erreichten (1), scheint eine vorübergehende Induktion oder Inhibierung eines Struktur- oder regulatorischen Proteins für dieses Phänomen verantwortlich zu sein.
Schlußfolgerungen
Generell kann konstatiert werden, daß Quarz trotz seiner chemisch inerten Eigenschaften eine Anzahl von für die systemische Sklerodermie pathogenetisch relevanten Zelltypen stimulieren kann (Grafik 2). Infolge dieser oder anderer Zellstimulationen, welche sich in erhöhten Zytokinspiegeln, Expression von Adhäsionsmolekülen oder auch erhöhter proteolytischer Aktivität äußern können, kommt es zu entzündlichen und fibrotischen Prozessen, welche unter bestimmten, bislang nicht bekannten Voraussetzungen zur Ausprägung der systemischen Sklerodermie führen können. Die untersuchten Effekte sind quarzspezifisch, da Titandioxid als inerte Kontrolle diese Wirkungen nicht zeigt und Quarz nicht toxisch auf die untersuchten Zellen wirkt. Als alleiniger Auslöser der Krankheit kann Quarz sicher nicht gesehen werden, aber aufgrund seiner langen Aufenthaltsdauer im Gewebe, die viele Zellgenerationen überdauert, kann sich seine Wirkung potenzieren und im Wechselspiel mit löslichen Mediatoren und individueller Prädisposition unbekannter Natur zur Entwicklung dieser systemischen Erkrankung beitragen. Trotz der Problematik der Zuordnung der gezeigten In-vitro-Daten zu In-vivo-Befunden ist die quarzinduzierte Zellaktivierung ein wichtiges Modell für die Untersuchung der Modulation von Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen durch exogene Faktoren, insbesondere im Hinblick auf Fibrosierungsprozesse und die Pathogenese der progressiven systemischen Sklerodermie.

Zitierweise dieses Beitrags:
Dt Ärztebl 1998; 95: A-1099-1103
[Heft 18]

Literatur
1. Anderegg U, Vorberg S, Herrmann K, Haustein UF: Increased expression of interstitial collagenase in silica-treated fibroblasts. Eur J Dermatol 1996; 6: 51-55.
2. Anderegg U, Vorberg S, Herrmann K, Haustein UF: Silica directly induces ICAM-1 expression in cultured endothelial cells. Eur J Dermatol 1997; 7: 27-31.
3. Anderegg U: Kann Siliziumdioxid über spezifische Zellaktivierung zur Pathogenese einer systemischen Sklerodermie beitragen? Eine in vitro Studie. Zeitschr Hautkrh 1997; 4: 265-270.
4. Frank R, Giese T, Dummer R et al.: Silica induces cytokine release in human monocyte cultures and its possible involvement in the pathophysiology of silica associated scleroderma. Eur J Dermatol 1993; 3: 304-309.
5. Gruschwitz M, Driesch von den P, Kellner I, Hornstein OP, Sterry W: Expression of adhesion proteins involved in cell-cell and cell-matrix interactions in the skin of patients with progressive systemic sclerosis. J Am Acad Dermatol 1992; 27: 169-177.
6. Haustein UF, Herrmann K: Environmental scleroderma. Clinics in Dermatology 1994; 12: 467-474.
7. Kulozik M, Scharffetter K, Herrmann K, Lankat-Buttgereit B, Heckmann M, Krieg T: Codistribution of collagen I and transforming growth factor bA2 gene expression in systemic sclerosis. J Invest Dermatol 1989; 92: 465.
8. Mauch C, Hatamochi A, Scharffetter K, Krieg T: Regulation of collagen synthesis in fibroblasts within a three dimensional collagen gel. Exp Cell Res 1988; 178: 493-503.
9. Mehlhorn J, Ziegler V, Keyn J, Vetter J: Quarzkristalle in der Haut als Ursache der progressiven systemischen Sklerodermie. Z Ges Inn Med 1990; 4: 149-154.
10. Saalbach A, Anderegg U, Schnabel E, Herrmann K, Haustein UF: A novel fibroblast specific antibody. Properties and specificities. J Invest Dermatol 1996; 106: 1314-1319.
11. Ziegler V, Keyn J, Mehlhorn J, Kipping D, Haustein UF: Quarznachweis in Sklerodermiehaut. Dermatol Monatsschr 1988; 174: 688-689.

Anschrift für die Verfasser
Prof. Dr. med. Uwe-Frithjof Haustein
Hautklinik der Universität Leipzig
Liebigstraße 21
04103 Leipzig