ArchivDeutsches Ärzteblatt24/1998Antisense-Oligonukleotide: Nukleinsäuren zur gezielten Synthesehemmung krankheitsfördernder Proteine

MEDIZIN: Aktuell

Antisense-Oligonukleotide: Nukleinsäuren zur gezielten Synthesehemmung krankheitsfördernder Proteine

Dtsch Arztebl 1998; 95(24): A-1524 / B-1296 / C-1213

Hartmann, Gunther; Bidlingmaier, Martin; Tschöp, Katharina; Eigler, Andreas; Hacker, Ulrich; Endres, Stefan

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LNSLNS Stichwörter: Antisense, therapeutisches Oligonukleotid, Pharmakotherapie
Molekularbiologische Techniken ermöglichen die Charakterisierung molekularer Mechanismen als Ursache von Krankheiten. Die Kenntnis molekularer Grundlagen von Erkrankungen ermöglicht nun die Entwicklung neuer Therapieformen auf genetischer Ebene. Während bei der Gentherapie zusätzliche genetische Information in die Zelle eingefügt wird, zielt die Anwendung von Antisense-Oligonukleotiden auf eine spezifische Hemmung der Bildung von Zielproteinen. Obwohl das Wirkprinzip von Antisense-Oligonukleotiden erstmals 1978 gezeigt werden konnte, ist es bis heute nicht vollständig gelungen, die methodischen Hürden hinsichtlich einer therapeutischen Anwendung zu überwinden. Dennoch zeigen erste klinische Studien mit AntisenseOligonukleotiden therapeutische Effekte bei weitgehend guter Verträglichkeit. Obwohl diese Studienergebnisse mit Zurückhaltung interpretiert werden müssen, ist anzunehmen, daß Antisense-Oligonukleotide längerfristig die Pharmakotherapie um ein grundsätzlich neues Wirkprinzip bereichern werden.


Key words: Antisense, therapeutic oligonucleotide, pharmacotherapy
The rationale of the antisense strategy is to inhibit synthesis of deleterious proteins by blocking the function of their corresponding mRNA. Antisense oligonucleotides are short strands of synthetic nucleic acid which bind target RNA by complementary base pairing. Oncogenic, proinflammatory and viral proteins can form targets of this approach. Once established as a new pharmacologic principle, the development of antisense oligonucleotides is expected to yield a number of valuable new drugs. Recently, antisense drugs have entered clinical trials. In the present overview, we summarize methodological aspects as well as current therapeutic concepts and clinical studies.


Während dem Wirkmechanismus zahlreicher Arzneimittel die Hemmung der Funktion von Proteinen zugrunde liegt, greift das Prinzip der Antisense-Technik an der Bildung dieser Proteine an. Ein Antisense-Oligonukleotid ist eine kurzkettige synthetische Nukleinsäure mit einer frei wählbaren Abfolge von Basen. Ein AntisenseOligonukleotid bindet über komplementäre Basenpaarung an eine Nukleinsäure, deren Basenabfolge dazu exakt paßt (Sense-Nukleinsäure). In dem entstehenden Nukleinsäure-Doppelstrang stehen sich immer die Basen Adenin und Thymidin sowie Cytidin und Guanidin gegenüber. Durch die spezifische Bindung des Antisense-Oligonukleotids an die komplementäre Sequenz der RNA des Zielproteins wird letztlich die Bildung des Zielproteins verhindert (Grafik 1). AntisenseOligonukleotide können synthetisch hergestellt und so modifiziert werden, daß eine ausreichende Stabilität gegenüber abbauenden Enzymen gewährleistet ist (Grafik 2). Die wichtigste dieser Modifikationen ist die sogenannte Phosphorothioat-Modifikation. Dabei wird ein Sauerstoffatom im Phosphat durch ein Schwefelatom ersetzt. Antisense-Oligonukleotide werden von Zellen in geringer Menge spontan aufgenommen. Zudem kann durch Verwendung bestimmter Träger-Lipide eine Verbesserung der Aufnahme (Transfektion) und eine für die Wirkung der Oligonukleotide günstigere intrazelluläre Verteilung erreicht werden (9).
Die Wirksamkeit von Antisense-Oligonukleotiden in Zellkultur und in vivo in Tiermodellen ist gut belegt (1, 12). Allerdings wurden neben der gezielten antisensevermittelten Hemmung des Zielproteins zusätzlich weitere Wirkungen von Antisense-Oligonukleotiden nachgewiesen, die unabhängig von dem Antisense-Effekt auftreten. Diese sogenannten nicht antisensevermittelten Wirkungen von Oligonukleotiden beruhen auf deren Bindung an Proteine (2, 6). Die Bindung von Antisense-Oligonukleotiden an einzelne Proteine kann abhängig oder unabhängig von der Basenabfolge des Oligonukleotids auftreten. Die dadurch entstehenden nicht antisensevermittelten Effekte werden von der Art der chemischen Modifikation des Oligonukleotids beeinflußt. In verschiedenen experimentellen Systemen konnten als solche nicht antisensevermittelten Effekte antivirale, antiadhäsive und immunstimulierende Wirkungen sowie eine Hemmung der Gefäßneubildung identifiziert werden (Grafik 3).
Die Gesamtwirkung eines Oligonukleotids setzt sich aus beiden Komponenten, antisense- und nicht antisensevermittelten Effekten, zusammen. Die Charakterisierung von nicht antisensevermittelten Effekten ermöglicht einerseits das Vermeiden von Basenabfolgen und Modifikationen, die unerwünschte Wirkungen von Oligonukleotiden verursachen. Andererseits können nicht antisensevermittelte Effekte von Oligonukleotiden bei bestimmten Indikationen auch erwünscht sein und die spezifische Antisense-Wirkung positiv ergänzen. So können beispielsweise die oben erwähnten Effekte wie die Hemmung der Adhäsion, die Immunstimulation und die Hemmung der Gefäßneubildung in Verbindung mit einem Antisense-Effekt gegen ein Tumorprotein synergistisch bei der Suppression des Tumorwachstums wirken.
In therapeutischer Hinsicht ist die nicht antisensevermittelte Immunstimulation durch Oligonukleotide von besonderem Interesse (8, 10). Dieser Effekt geht auf generelle Unterschiede in der Basenzusammensetzung bakterieller DNA und der DNA von Wirbeltieren zurück. In bakterieller DNA kommt die Zweiersequenz Cytidin-Base mit darauffolgender Guanidin-Base (CpG-Dinukleotid) häufig vor. In der DNA von Wirbeltieren ist diese Zweiersequenz weniger häufig und durch Anlagerung einer Methylgruppe an der Base Cytidin verändert (im Gegensatz zu nicht methylierter bakterieller DNA). Wirbeltiere erkennen über einen bislang nicht geklärten Mechanismus diesen Unterschied in der Basenzusammensetzung von DNA. Bei Wirbeltieren führt die Erkennung von bakterieller DNA zu der Aktivierung einer unspezifischen Immunantwort. Die immunstimulierende Eigenschaft bakterieller DNA kann von synthetischen Oligonukleotiden imitiert werden, die CpG-Dinukleotide enthalten und deren Basen nicht methyliert sind. Eine Phosphorothioat-Modifikation dieser Oligonukleotide verstärkt deren immunstimulierende Wirkung (8). Bakterielle DNA oder Oligonukleotide mit CpG-Dinukleotiden aktivieren B-Lymphozyten zur Proliferation und zu erhöhter Immunglobulin-Synthese. Auch Monozyten, Makrophagen und dendritische Zellen werden direkt aktiviert. In diesen Zellen kommt es zu einer verstärkten Synthese der Zytokine Tumor-Nekrose-Faktor-a und Interleukin-12. Bakterielle DNA oder Oligonukleotide mit CpG-Dinukleotiden üben jedoch keinen direkten Einfluß auf T-Lymphozyten aus.
Therapeutische Konzepte
Auf dem Gebiet der therapeutischen Oligonukleotide zeichnen sich zwei Richtungen ab: die antisensevermittelte gezielte Hemmung der Bildung von Zielproteinen und die Nutzung des immunstimulierenden CpG-vermittelten Effektes bestimmter Oligonukleotid-Sequenzen.
Bei inflammatorischen, onkologischen und viralen Erkrankungen sind Proteine bekannt, die wesentlich zur Pathogenese der jeweiligen Erkrankung beitragen. So führt bei inflammatorischen Erkrankungen die Hemmung der Bildung proinflammatorischer Zytokine und leukozytärer/ endothelialer Adhäsionsmoleküle zu einer Verminderung der unerwünschten Entzündungsreaktion. Beispielsweise wurde für das proinflammatorische Zytokin Tumor-Nekrose-Faktor-a (TNFa) eine zentrale Mediatorfunktion bei akuten und chronisch entzündlichen Erkrankungen nachgewiesen (5). Die Synthese von TNFa kann mit Antisense-Oligonukleotiden in Zellkultur spezifisch gehemmt werden (7). Unter den leukozytären Adhäsionsmolekülen besitzt ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1) eine zentrale Bedeutung bei der Bindung verschiedener Entzündungszellen untereinander und an das Gefäßendothel. Mit der Hemmung der Expression von ICAM-1 durch AntisenseOligonukleotide ist daher ein entzündungshemmender Effekt zu erwarten.
Bei Tumorerkrankungen tragen in der Regel mehrere proliferationsfördernde Proteine (Onkogene) parallel zum Wachstum eines Tumors bei. Deshalb ist die Hemmung einzelner onkogener Proteine wenig erfolgversprechend. Bestimmte Proteinkinasen spielen jedoch eine übergeordnete Rolle in der Regulation von Proliferation und Differenzierung von Zellen. Bei Leukämie-Zellinien führt die Hemmung der Proteinkinase A1 (PKA1) mit einem Antisense-Oligonukleotid zu einer Gleichgewichtsverschiebung zugunsten der Expression der Proteinkinase A2 (PKA2). Damit verbunden ist eine Hemmung der Proliferation und eine zunehmende Differenzierung der Tumorzellen. Auch für die Hemmung der Expression der Proteinkinasen Ca (PKCa) mit Antisense-Oligonukleotiden konnte eine Verminderung des Wachstums von verschiedenen tierexperimentellen Tumoren nachgewiesen werden.
Neben Proteinkinasen bietet die Apoptose, der programmierte Zelltod, einen wichtigen übergeordneten Angriffspunkt bei Tumoren. In einem intakten Zellverband wird in einer Zelle mit einem irreparablen Schaden am Erbgut die Apoptose ausgelöst. Das Apoptose-Schutzprotein bcl2 (B-cell leukemia/lymphoma 2) erhöht die Schwelle, ab der die Apoptose in Gang gesetzt wird. Tumorzellen weisen ausgeprägte Veränderungen im Erbgut auf und schützen sich gegenüber dem programmierten Zelltod durch eine verstärkte Expression des ApoptoseSchutzproteins bcl2. Die therapeutische Hemmung der Bildung von bcl2 durch Antisense-Oligonukleotide zielt auf eine Senkung der Schwelle von Tumorzellen für die Apoptose. Da viele Chemotherapeutika über eine Induktion der Apoptose wirken, ist die Kombination von Chemotherapeutika mit einer Hemmung der bcl2Expression besonders erfolgversprechend.
Auch die Bildung viraler Proteine kann in experimentellen Studien durch Antisense-Oligonukleotide gehemmt werden. Antisense-Oligonukleotide, die gegen bestimmte Gene des HIV (Humanes Immundefizienzvirus), des HPV (Humanes Papillomavirus) und des CMV (Zytomegalievirus) gerichtet sind, inhibieren die VirusReplikation. Punktmutationen im viralen Genom schränken die langfristige Wirksamkeit von AntisenseOligonukleotiden bei Viren jedoch ein.
Neben der antisensevermittelten Hemmung von Zielproteinen läßt sich auch die CpG-vermittelte, immunstimulierende Wirkung von bestimmten Oligonukleotid-Sequenzen therapeutisch nutzen (11). Immunstimulierende Oligonukleotide zeigten sich in tierexperimentellen Studien als potente Adjuvantien bei der konventionellen Impfung gegen Infektionen. Weiterhin wurde nachgewiesen, daß das Funktionieren einer neuen, in Entwicklung befindlichen Impftechnik, der Immunisierung mit "nackter" DNA (DNA-Vakzinierung), abhängig ist von der Anwesenheit immunstimulierender Nukleinsäure-Sequenzen in der applizierten DNA (13). Auch haben immunstimulierende Oligonukleotide in Kombination mit tumorspezifischen Antikörpern bei der Immuntherapie von experimentellen Tumoren positive Effekte gezeigt.
Klinische Studien
Die wichtigsten klinischen Studien sind in der Tabelle zusammengefaßt. Die systemische Applikation von Antisense-Oligonukleotiden in therapeutischer Dosierung wird gut vertragen. !
Nach positiven Ergebnissen von Phase-II-Studien wurde das Antisense-Oligonukleotid ISIS 2922 (Fomivirsen: phosphorothioatmodifiziertes Oligodeoxyribonukleotid, 20mer) in klinischen Studien zur Behandlung von virostatikarefraktärer Cytomegalie-Virus(CMV-)-Retinitis bei Patienten mit AIDS untersucht. Im März 1998 wurden die Phase-III-Studien hierzu mit positivem Resultat abgeschlossen. Die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) der CMV-Replikation in vitro beträgt für Fomivirsen 0,06 µM, für das Nukleosid-Analogon Ganciclovir (Cymeven) 30fach höher (2 µM). Fomivirsen wird über eine schmerzfreie Injektion in den Glaskörper verabreicht, in den ersten drei Wochen je einmal wöchentlich, danach alle zwei Wochen. In einer Zwischenauswertung der Studie (60 Patienten) zeigte sich bei 30 Prozent der behandelten Patienten eine Rückbildung der Retinitis (Dauer bis zu 100 Tage). Weitere Studienprotokolle untersuchen die optimale Dosierung in Abhängigkeit vom Stadium der Erkrankung und die Möglichkeit einer Kombination mit Ganciclovir.
Bei Patienten mit Morbus Crohn wird die Wirksamkeit des Antisense-Oligonukleotids ISIS 2302 gegen das Adhäsionsmolekül ICAM-1 untersucht. In einer plazebokontrollierten Phase-II-Studie an Patienten mit therapierefraktärem Morbus Crohn (Therapiegruppe 15 Patienten, Plazebogruppe fünf Patienten) wurde ISIS 2302 einen Monat lang jeden zweiten Tag als Infusion gegeben (4). Es zeigte sich eine signifikante Einsparung an Steroiden in der behandelten Gruppe. Eine multizentrische Phase-II-Studie (40 Zentren) soll nun diese positiven Effekte bestätigen.
Die Hemmung des Apoptose-Schutzproteins bcl2 mit einem Antisense-Oligonukleotid (Grafik 4) hat in einer nicht kontrollierten Studie an einer kleinen Gruppe von Patienten (n = 9) mit therapierefraktärem Non-Hodgkin-Lymphom bei einem Patienten zu einer kompletten Remission geführt (14). Bei einem weiteren Patienten zeigte sich eine Verringerung des Tumorvolumens. Zur Dokumentation des Wirkmechanismus konnte bei zwei von neun Patienten eine Verminderung der bcl2-Expression nachgewiesen werden.
Perspektiven
Das Konzept einer zielgerichteten Hemmung der Bildung krankheitsverursachender Proteine mit AntisenseOligonukleotiden zeigt in klinischen Studien bei viralen, inflammatorischen und Tumor-Erkrankungen erste positive Ergebnisse. Die Wirksamkeit eines Antisense-Oligonukleotids gegen die CMV-Retinitis bei AIDSPatienten ist nachgewiesen. Die Untersuchungen bei Patienten mit Morbus Crohn und mit Non-HodgkinLymphom wurden bisher an kleinen Patientenkollektiven durchgeführt und müssen noch in größeren Studien bestätigt werden.
Oligonukleotide mit verbesserten Eigenschaften sind in der Entwicklung. Die chemischen Modifikationen dieser Oligonukleotide gewährleisten sowohl eine höhere Affinität an die Ziel-RNA als auch eine höhere Stabilität gegenüber Nukleasen. Damit verbunden ist eine Verstärkung der spezifischen Antisense-Wirkung und eine Verminderung von begleitenden unerwünschten Nicht-Antisense-Effekten. Einzelne dieser Verbindungen zeigen auch nach oraler Applikation eine ausreichende Bioverfügbarkeit. Die orale Gabe wird derzeit in einer klinischen Phase-I-Studie getestet (Tabelle).
Unter den nicht antisensevermittelten Effekten sind insbesondere die immunstimulierenden Eigenschaften definierter Nukleinsäure-Sequenzen von therapeutischem Interesse. Vielversprechend ist die Anwendung immunstimulierender Oligonukleotide als Adjuvans bei Impfungen und im Rahmen der Immuntherapie von Tumoren. Die weitere Charakterisierung des zugrundeliegenden Mechanismus wird derzeit intensiv untersucht.
Insgesamt ist zu erwarten, daß therapeutische Oligonukleotide für ausgewählte Indikationen in absehbarer Zeit Eingang in die Klinik finden werden. International, mit Schwerpunkt in den USA, Kanada und der Schweiz arbeiten zahlreiche biotechnologische Unternehmen an der Entwicklung von Oligonukleotiden als neuen Therapeutika. In Deutschland zählen dazu die Forschungsabteilungen der Unternehmen Byk Gulden, Hoechst und Boehringer Ingelheim. Allerdings werden erst weitere klinische Studien zeigen, ob bestimmte AntisenseOligonukleotide den heute etablierten Therapieformen tatsächlich überlegen sind.
Zitierweise dieses Beitrags:
Dt Ärztebl 1998; 95: A-1524-1530
[Heft 24]
Literatur
1. Askari FK, McDonnell MW: Antisense-oligonucleotide therapy. New Engl J Med 1996; 334: 316-320.
2. Benimetskaya L, Loike JD, Khaled Z et al.: Mac-1 (cdllb/cd18) is an oligodeoxynucleotide binding protein. Nat Med 1997; 3: 414-420.
3. Bidlingmaier M, Krug A, Hartmann G: How to characterize and improve oligonucleotide-uptake into leukocytes. In: Manual of Antisense Methodology. Hartmann G, Endres S (Eds); Kluwer Academic Publishers, Boston, 1998; (im Druck).
4. Bradbury J: Antisense drugs move towards the clinic. Lancet 1997; 349: 259.
5. Eigler A, Sinha B, Hartmann G, Endres S: Taming TNF: Strategies to restrain this proinflammatory cytokine. Immunol Today 1997; 18: 487-492.
6. Hartmann G, Bidlingmaier M, Jahrsdörfer B, Endres S: Playground of oligonucleotides: extrapolation from in vitro to in vivo? Nat Med 1997 (letter); 3: 702.
7. Hartmann G, Krug A, Eigler A et al.: Specific suppression of human tumor necrosis factor-a synthesis by antisense oligodeoxynucleotides. Antisense Nucleic Acid Drug Develop 1996; 6: 291-299.
8. Hartmann G, Krug A, Waller-Fontaine K, Endres S: Oligodeoxynucleotides enhance lipopolysaccharide-stimulated synthesis of tumor necrosis factor: Dependence on phosphorothioate modification and reversal by heparin. Mol Med 1996; 2: 429-438.
9. Hartmann G, Krug A, Bidlingmaier M, Hacker U, Eigler A, Albrecht R, Strasburger CI, Endres S: Spontaneous and cationic lipid-mediated uptake of antisense oligonucleotides in human monocytes and lymphocytes. J Pharmacol Exp Ther 1998; (im Druck).
10. Krieg AM, Yi AK, Matson S et al.: CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. Nature 1995; 374: 546-549.
11. Krieg AM, Yi AK, Schorr J, Davis H: The role of CpG dinucleotides in DNA vaccines. Trends Microbiol 1998; 6: 23-27.
12. Nyce JW, Metzger WJ: DNA antisense therapy for asthma in an animal model. Nature 1997; 385: 721-725.
13. Sato Y, Roman M, Tighe H et al.: Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization. Science 1996; 273: 352-354.
14. Webb A, Cunningham D, Cotter F et al.: BCL-2 antisense therapy in patients with non-Hodgkin lymphoma. Lancet 1997; 349: 1137-1141.
15. Zamecnik PC, Stephenson ML: Inhibition of Rous sarcoma virus replication and cell transformation by a specific oligodeoxynucleotide. Proc Natl Acad Sci (USA) 1978; 75: 280-284.
Anschrift für die Verfasser
Prof. Dr. med. Stefan Endres
Abteilung für Klinische Pharmakologie
Medizinische Klinik
Klinikum Innenstadt der LudwigMaximilians-Universität München
Ziemssenstraße 1 · 80336 München


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