ArchivDeutsches Ärzteblatt49/2018Diagnostik von Blutstrominfektionen

MEDIZIN: cme

Diagnostik von Blutstrominfektionen

Neue mikrobiologische Verfahren in der klinischen Praxis und Entwicklung

New microbiological techniques in the diagnosis of bloodstream infections

Dtsch Arztebl Int 2018; 115: 822-32; DOI: 10.3238/arztebl.2018.0822

Idelevich, Evgeny A.; Reischl, Udo; Becker, Karsten

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Hintergrund: Sowohl Zwischen- als auch Endergebnisse kulturbasierter Verfahren stehen beim Verdacht auf Blutstrominfektionen zu spät zur Verfügung, um Einfluss auf die initiale kalkulierte Antibiotikatherapie nehmen zu können.

Methode: Selektive Literaturrecherche sowie eigene diagnostische und wissenschaftliche Erfahrungen.

Ergebnisse: Mehrere technologische Entwicklungen trugen zur Beschleunigung der mikrobiologischen Diagnostik von Blutstrominfektionen bei. DNA-basierte Verfahren zum direkten Erregernachweis aus Vollblut konnten sich aufgrund von Limitationen bisher nicht als Routineanwendungen durchsetzen. Die laboralltagstauglich gewordene „Matrix assisted laser desorption/ionization—time of flight“ (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie (MS) führte zur deutlichen Verkürzung der Diagnostikzeiten nach Positivmeldung der in den Blutkulturautomaten kultivierten Blutproben. Weiterentwicklungen dieses Verfahrens ermöglichen ihren Einsatz direkt für positiv gemeldete Blutkulturen beziehungsweise für die Verwendung nur kurz auf einem Festnährmedium zwischenbebrüteter Subkulturen. Die mikrobielle Biomasse dieser Subkultur lässt sich parallel auch für eine schnellere Empfindlichkeitstestung mittels konventioneller Verfahren oder zukünftig auch mittels MALDI-TOF-MS einsetzen.

Schlussfolgerung: Für alle Verfahren sind zur Potenzialentfaltung eine optimale Einbettung in die diagnostischen Abläufe sowie die Beachtung präanalytischer Aspekte (insbesondere Lagerungs- und Transportzeiten) entscheidend.

LNSLNS

Von Anbeginn stand die diagnostische Mikrobiologie vor der Aufgabe, sicher und möglichst schnell Erreger zu identifizieren und zu charakterisieren. Dies gilt insbesondere für die Diagnostik von Blutstrominfektionen da diese – gerade bei der Sepsis – eine akute Gefährdung des Patienten darstellen (e1).

Die besondere Relevanz einer schnellen Erregerdiagnostik ergibt sich aus der Erregervirulenz und der Existenz resistenter Erreger-Phänotypen und wirtsseitig aus der zunehmend infektionsgefährdeteren Patientenstruktur mit immer mehr älteren, multimorbiden, immunkompromittierten und/oder mit Fremdkörpern versehenen Patienten (e2).

Die Geschwindigkeit der kulturellen Erregerdiagnostik ist durch die Mikroorganismen-Teilungsraten biologisch limitiert. Dies führte dazu, dass traditionell für jeden kulturbasierten Diagnostikschritt (primäre Anzucht, Isolierung von Mischkulturen, biochemische Identifizierung und Empfindlichkeitstestung) jeweils „Übernacht“-Kultivierungen stattfinden, die sich zu oft mehrtägigen (≥ 2–3 Tage) Diagnostikzeiten aufaddierten. Somit kam es einer Revolution gleich, als mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) die Nukleinsäureamplifikationstests (NAT) Einzug hielten, die den Erregernachweis beschleunigen und für schwierig oder nicht kultivierbare Erreger auch eine höhere Sensitivität und Spezifität erreichen konnten (1, e3, e4) (Abbildung). Derzeit haben massenspektrometrische Verfahren die Erregerdiagnostik erneut revolutioniert und sind vielerorts bereits Teil der Routinediagnostik. Weitere Umwälzungen sind durch die routinemäßige Ganzgenom- beziehungsweise Mikrobiomsequenzierung sowie die Automatisierung kulturbasierter Prozeduren zu erwarten.

Unterschiedlich lange bebrütete Enterobacter-cloacae-Kulturen auf einem Festnährmedium (Blutagarplatten) und ihr Einsatz in der Diagnostik
Unterschiedlich lange bebrütete Enterobacter-cloacae-Kulturen auf einem Festnährmedium (Blutagarplatten) und ihr Einsatz in der Diagnostik
Abbildung
Unterschiedlich lange bebrütete Enterobacter-cloacae-Kulturen auf einem Festnährmedium (Blutagarplatten) und ihr Einsatz in der Diagnostik

Lernziele

Der Leser soll nach der Lektüre:

  • Wesentliches zu Neu- und Weiterentwicklungen in der Erregerdiagnostik erfahren haben
  • die Vorteile, aber auch Limitationen dieser Verfahren bewerten können
  • den Einsatz der neuen Technologien am Beispiel der Diagnostik von Blutstrominfektionen kennengelernt haben.

Methoden

Der Übersichtsartikel beruht auf selektiver Literaturrecherche und eigenen diagnostischen und wissenschaftlichen Erfahrungen zum Einsatz von NAT und „matrix-assisted laser desorption/ionization—time-of-flight“ (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie (MS) zur mikrobiologischen Diagnostik von Blutstrominfektionen.

Grundlagen und Überblick

Heute gehören PCR, alternative NAT sowie Sequenzierverfahren zum selbstverständlichen Repertoire mikrobiologischer Diagnostik. Sie finden mit ihren Weiterentwicklungen breiten Einsatz zum direkten Erregernachweis beziehungsweise zur molekularen Identifizierung kultivierter Mikroorganismen, zur Detektion von Resistenzgenen oder Virulenzfaktoren sowie zur Genotypisierung (e5e8). Andererseits findet wieder zunehmend Aufmerksamkeit, dass Kulturverfahren per se hochsensitiv sind (eine in vitro vermehrungsfähige mikrobielle Zelle ist ausreichend) und nur das Kulturisolat die Bestimmung des Resistenzphänotyps ermöglicht, die mehr als die Summe aller resistenzkodierenden Gene beziehungsweise Mutationen ist. Innovative Entwicklungen zur kulturbasierten Diagnostik dienen auch hier dem Ziel, schneller, sensitiver und spezifischer Erreger nachzuweisen.

Sowohl molekulargenetische Tests als auch auf dem Kulturisolat beruhende phänotypische Charakterisierungen besitzen jeweils methodeninhärente Limitationen, aber auch besondere diagnostische Vorteile. Je nach Indikation können beide diagnostischen Strategien in synergistischer Weise zu einer validen Erregeridentifizierung und Empfindlichkeitsbestimmung sowie zur weiteren Erregercharakterisierung beitragen.

Hinsichtlich ihres Einflusses auf die Qualität und Geschwindigkeit der Erregeridentifizierung vergleichbar mit der damaligen „PCR-Revolution“ ist die Einführung massenspektrometrischer Verfahren in die mikrobiologische Routinediagnostik. MALDI-TOF-MS-Systeme haben im Verlauf nur weniger Jahre in vielen Laboratorien die konventionelle Erregeridentifizierung mittels biochemischer Verfahren fast vollständig abgelöst und sind auf dem Weg, auch zur Antibiotikaempfindlichkeitstestung eingesetzt zu werden (e9e12).

Erregernachweis mittels Nukleinsäure-Diagnostik

Die Vorteile der PCR und anderer NAT (Grafik 1) als kulturunabhängige Verfahren mit hohen Sensitivitäten und Spezifitäten führten nach ihrer Erstbeschreibung im Jahr 1985 zur schnellen Akzeptanz der Nukleinsäure-basierten Diagnostik (e3). Typischerweise werden in diesem Verfahren analytische Sensitivitäten von 1 bis 100 Erregeräquivalenten an bakterieller oder fungaler DNA erreicht. Komplexe beziehungsweise Untersuchungsmaterialien mit inhomogener Erregerverteilung (zum Beispiel Gewebe, Blut, Stuhl) können zu drastischen Sensitivitäts- und Spezifitätsminderungen führen. Die NAT-Spezifität ist stark abhängig von der Auswahl der Zielstrukturen, der Primer- und Sondenkomposition und den PCR-/Microarray-Reaktionsbedingungen. Die offensichtlichen Vorteile der NAT führten oft zu einem unreflektierten und unzureichend validierten Einsatz (e13). So wurden unter anderem der Einfluss präanalytischer Faktoren, die Bedeutung einer optimalen Nukleinsäure-Extraktion sowie Kontaminationsgefahren oft unterschätzt (e14e16). Um ähnlichen „Fallstricken“ bei den derzeitigen technologischen Innovationen vorzubeugen, ist es essenziell, dass deren Testergebnisse in den Kontext mit anderen Befunden gestellt und kritisch bewertet werden (Kasten 1).

Gezielter und ungezielter Erregernachweis mittels DNA-basierter Methoden
Gezielter und ungezielter Erregernachweis mittels DNA-basierter Methoden
Grafik 1
Gezielter und ungezielter Erregernachweis mittels DNA-basierter Methoden
Fragen zur Bewertung von NAT-Befunden
Fragen zur Bewertung von NAT-Befunden
Kasten 1
Fragen zur Bewertung von NAT-Befunden

Kann das Infektionsgeschehen mittels konventioneller Diagnostik und speziesspezifischer NAT nicht auf das Vorliegen von definierten Pathogenen zurückgeführt werden, so können speziesübergreifende („broad range“) Nukleinsäure-basierte Methoden eingesetzt werden (Grafik 1, eSupplement 1) (2, 3, e16e19).

Auf der Schwelle zur Routinetauglichkeit stehen derzeit die Whole-Genome-(WGS) und Whole-Metagenome-Sequenzierungsverfahren (WMS) mittels sogenannter Next-Generation-Sequenzierungstechnologien (NGS) (eSupplement 1) (46, e20e22).

Angesichts der Vielfalt der verschiedenen NAT-Systeme bezüglich des Detektionsumfanges, möglicher Einsatzbeschränkungen für die verschiedenen Untersuchungsmaterialien und der Unterschiede in den Gütekriterien (Sensitivität, Spezifität, prädikative Werte) empfiehlt sich eine enge Zusammenarbeit zwischen Klinik und mikrobiologischem Laboratorium, um eine optimierte Auswahl angepasst an die jeweiligen klinischen Erfordernisse treffen zu können. Das trifft besonders zu, wenn NAT-Verfahren zusätzlich zur konventionellen Diagnostik eingesetzt werden.

MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Der Einsatz von Massenspektrometrie zur Erregeridentifikation wurde bereits in den 1970er Jahren vorgeschlagen, jedoch erst später entwickelten die deutschen Biophysiker Franz Hillenkamp und Michael Karas mit der MALDI-TOF-MS (zum Prinzip, siehe eSupplement 1) ein routinetaugliches Verfahren (e23, e24). Es erfolgt eine massenspektrometrische Auftrennung mikrobieller, vorrangig ribosomaler Proteine, wobei die gewonnenen Daten für die Identifikation von bakteriellen und fungalen Mikroorganismen verwendet werden. Ihre Hauptvorteile liegen in der extremen Schnelligkeit (Minuten) und Kostengünstigkeit einzelner Analysen bei hoher Spezifität. Obwohl es sich eigentlich um ein phänotypisches Verfahren handelt, beruht ihre einem NAT-Verfahren nahezu gleichkommende hohe Spezifität auf dem hohen Anteil ribosomaler Proteine im erzeugten Massenspektrum, die die ribosomalen Nukleinsäuresequenzen quasi widerspiegeln.

Einhergehend mit Verbesserungen der analytischen Methodik, Analyse-Softwareentwicklung und gerätetechnischer Umsetzung hat die MALDI-TOF-MS rasanten Eingang in die klinisch-mikrobiologische Diagnostik gefunden. Mittlerweile ist sie zum Standard für die Identifikation von Bakterien und Hefepilzen geworden und hat zu erheblichen Veränderungen diagnostischer Routineabläufe geführt (7, e25, e26). Die MALDI-TOF-MS-bedingte Verkürzung von Identifizierungszeiten kann zu Verbesserungen des klinischen Ergebnisses (zum Beispiel von Überlebensraten) führen (810).

Prämissen zur Erregerdiagnostik bei Blutstrominfektionen

Blutstrominfektionen einschließlich Sepsis und insbesondere der septische Schock stellen eine der größten Herausforderungen für die Diagnostik und Therapie dar, wobei der Erkenntnisfortschritt im letzten Vierteljahrhundert unser Verständnis zum Wesen der Sepsis gewandelt und zu veränderten Definitionen (derzeit „The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock – Sepsis-3“) geführt hat (e1, e27). Noch immer ist die mikrobiologische Diagnostik nicht ausreichend sensitiv, um den Erreger in allen Fällen von Blutstrominfektionen sicher zu detektieren und insbesondere aber weiterhin zu langsam, um unmittelbar für die kalkulierte (in der angelsächsischen Literatur als „empirische“ bezeichnete) antibiotische Initialtherapie von Nutzen zu sein. Unersetzbar ist sie jedoch für die spezifische Antibiotikatherapie nach Erregeridentifizierung und Empfindlichkeitstestung sowie mittelbar als Datenbasis für die kalkulierte Therapie. Eine zeitgemäße mikrobiologische Diagnostik muss sich daran messen, inwieweit sie die Sensitivität in der Diagnostik von Blutstrominfektionen erhöhen und sie sich der sogenannten „goldenen Stunde“ der initialen Antibiotikatherapie annähern kann.

Die sepsisbedingte Mortalität kann deutlich gesenkt werden, wenn eine adäquate antimikrobielle Therapie frühzeitig initiiert wird. Für die Prognose ist die erste Stunde nach Einsetzen der Symptomatik entscheidend (11). Obwohl entsprechende randomisierte klinische Studien mit signifikanten Aussagen zur Mortalität und Dauer des stationären Aufenthaltes nicht vorliegen, könnte eine schnellere mikrobiologische Diagnostik erhebliche Vorteile für die Therapie von Blutstrominfektionen bringen (12, e28e30). Frühe Studien konnten einen signifikanten Einfluss von schneller Erregeridentifizierung und Empfindlichkeitstestung auf die Mortalitätsraten, die Aufenthaltsdauer im Intensivbereich und die Kosten belegen (e30).

Grundsätzlich sei auch darauf verwiesen, dass sowohl die klassische Erregeranzucht als auch molekulare Verfahren per se nur die Anwesenheit eines Mikroorganismus (Bakteriämie beziehungsweise Fungämie) beziehungsweise seiner DNA in einer Probe nachweisen. Die Qualifizierung eines mikrobiologischen Befundes als kausativen Erreger von Blutstrominfektionen erfordert den klinischen Kontext und die Gesamtschau aller infektionsrelevanten Parameter.

Weltweit sind – trotz partieller regionaler beziehungsweise nationaler Erfolge bei der MRSA-Eindämmung – steigende Raten multiresistenter Erreger zu verzeichnen (e31e35). Aus diesem Grund und angesichts einer begrenzten Anzahl von neuen marktverfügbaren Antibiotika (e36, e37) ist eine adäquate Auswahl der antimikrobiellen Therapie nicht nur für den konkreten Patienten, sondern auch für die Senkung des Selektionsdruckes zur Resistenzentwicklung entscheidend.

Eine auf den Ergebnissen von Identifizierung und Empfindlichkeitstestung basierende schnelle Umstellung auf eine gezielte Therapie muss daher im Sinne von „diagnostic und antibiotic stewardship“-Strategien angestrebt werden.

Fortschritte bei der Diagnostik von Blutstrominfektionen

Die herkömmliche Diagnostik von Blutstrominfektionen besteht aus drei Schritten:

  • Inokulation des Patientenblutes in ein Flüssigmedium (Blutkulturflaschen) zur primären Erregeranzucht
  • nachfolgender Subkultivierung auf Festnährmedien
  • Identifizierung und Antibiotikaempfindlichkeitstestung (Grafik 2).

Dieses Prozedere umfasst konventionell 3–4 Tage beziehungsweise bei beeinträchtigten (Antibiotika-vorbehandelten) oder langsam wachsenden Erregern auch mehr und ist daher nicht schnell genug, um als Grundlage für frühe therapeutische Entscheidungen zu dienen (11).

Seit Jahrzehnten erfolgt die Bebrütung der Blutkulturflaschen mittels Blutkulturautomaten, die mikrobielles Wachstum registrieren und bei Erreichen eines Detektionsschwellenwertes ein Signal geben (e38). Zur Speziesidentifizierung und Empfindlichkeitstestung wird üblicherweise ein Transfer vom Flüssignährmedium auf Festnährmedien mit nachfolgender Übernachtbebrütung zur Erzielung von Einzelkolonien vorgenommen. Parallel zur Anlage auf Festnährmedien wird ein Gram-Präparat angefertigt und mikroskopiert (Grafik 2). Dessen Befund wird dem Kliniker im Idealfall 20–30 Minuten nach Positivmeldung der Blutkultur mitgeteilt und zur Anpassung der Antibiotikatherapie herangezogen.

Prozesse und Zeiten
Prozesse und Zeiten
Grafik 2
Prozesse und Zeiten

Bis vor kurzem basierte die nachfolgende Identifizierung der mikrobiellen Einzelkolonien fast ausschließlich auf dem Einsatz biochemischer Methoden, die ein erneutes mikrobielles Wachstum über mehrere Stunden erforderten und oft erst nach erneuter Übernachtbebrütung ausgewertet wurden. Möglichkeiten zur Beschleunigung der Erregerdiagnostik von Blutstrominfektionen beruhen entweder auf einer schnelleren Identifizierung der Erreger aus positiv gemeldeten Blutkulturflaschen oder dem NAT-basierten Erreger-Direktnachweis aus Blutproben als ein die Kultivierung ergänzendes Schnellverfahren (Grafik 2).

Schnellere Erregeridentifizierung positiv gemeldeter Blutkulturflaschen

DNA-basierte Verfahren

In den letzten Jahren wurden kommerzielle Multiplex-PCR- beziehungsweise Microarray-basierte Verfahren entwickelt, die eine Detektion und Identifikation der Erreger aus dem flüssigen Nährmedium positiv gemeldete Blutkulturen innerhalb von 1–4 Stunden ermöglichen (e39e44).

Eine randomisierte kontrollierte Studie zeigte, dass diese Vorgehensweise hilfreich für die Optimierung der antimikrobiellen Therapie bei Blutstrominfektionen sein kann; Vorteile bezüglich Mortalität oder Dauer des stationären Aufenthaltes waren jedoch nicht belegbar (13). Gegenargumente umfassen die hohen Kosten, den zusätzlichen Arbeitsaufwand, die unklaren Auswahlkriterien für zu untersuchende Proben, die limitierte Anzahl nachweisbarer Erreger und vor allem die Inaugurierung der MALDI-TOF-MS-Technologie als routinetaugliches Verfahren (14).

Massenspektrometrische Verfahren

Für eine direkte Erregeridentifikation aus positiv gemeldeten Blutkulturflaschen mittels MALDI-TOF-MS ist eine Probenaufbereitung durch vorgeschaltete Verfahren, wie das Lysis-Zentrifugation-Verfahren mit anschließender Äthanol-/Ameisensäure-Extraktion notwendig. Diese Schnellmethode – als „in house“-Adaptation oder als kommerzielles Verfahren verfügbar – zeigte Identifikationsraten von bis zu über 80 % innerhalb von circa 20–40 min beim Nachweis bakterieller Erreger (7, 1517). Bei Hefepilzen gelang eine direkte Identifikation in 62,5 % der Proben (18).

Diese Vorgehensweise hat sich jedoch nicht allgemein durchgesetzt. Die Gründe hierfür liegen in einem relativ hohen zusätzlichen Aufwand, erhöhten Reagenzienkosten, mäßigen Identifizierungsraten sowie in der Einstufung als „add-on“-Diagnostik, da sie die Festnährmedien-Subkultivierung nicht ersetzt. Das führte dazu, dass die Proben aus organisatorischen Gründen nur schubweise (zum Beispiel zweimal täglich oder seltener) verarbeitet wurden und der antizipierte Schnelligkeitsvorteil sich deutlich relativierte (10, 16, 19). Daher bestand der Bedarf, ein kostengünstigeres und besser in die Routine integrierbares Verfahren zu finden (14, 20). Anstatt von üblichen „reifen“ Kolonien nach Übernachtbebrütung auszugehen, wurden nur sehr kurz auf Festmedien bebrütete Subkulturen aus positiv gemeldeten Blutkulturen verwendet (7). Hierzu wurde das Wachstum frisch beimpfter Festnährmedien engmaschig verfolgt. Beim erstmaligen visuellen Feststellen mikrobieller Biomasse (als feiner „Hauch“) wurde hiermit eine MALDI-TOF-MS-Analyse durchgeführt (Grafik 1) Es zeigt sich, dass mikrobielles Koloniematerial für die MALDI-TOF-MS-Analyse bereits nach Sichtbarwerden eines (hauchartigen) Wachstums auf einem Festnährmedium für ein verwertbares Analyseergebnis einsetzbar ist. Die mittlere Bebrütungszeit bis zur erfolgreichen Speziesidentifizierung betrug bei gramnegativen Stäbchen nur 2,0 Stunden und bei grampositiven Kokken 5,9 Stunden (3,1 Stunden mit vorheriger Proteinextraktion). Das Identifikationsergebnis war stets identisch mit dem Ergebnis bei Verwendung von Kulturen, die 24 Stunden bebrütet wurden (7). Das Verfahren ist unproblematisch in die Routineabläufe eines mikrobiologischen Laboratoriums integrierbar und erfordert keine zusätzlichen Verbrauchsmaterialien und Durchführungszeiten. Nachfolgende Studien konnten die Vorteile bestätigen (2124). Zusätzlich lässt sich dieses Identifikationsverfahren vorteilhaft mit einer schnelleren Empfindlichkeitstestung kombinieren (25).

Direkte DNA-basierte Erregeridentifizierung aus Vollblut

Um die mikrobiologische Diagnostik von Blutstrominfektionen direkt aus Vollblutproben deutlich zu beschleunigen, wurden verschiedene experimentelle, später auch kommerziell verfügbare, speziesspezifische oder speziesübergreifende NAT eingeführt (26, e45e47). Je nach Testsystem kann bei Multiplex-PCR-Systemen nach circa 3,5–8 Stunden ein Ergebnis vorliegen. Speziesübergreifende NAT-Testverfahren benötigen durch die erforderliche Sequenzierung des PCR-Amplifikats deutlich mehr Zeit (etwa plus einem Arbeitstag). NAT-Verfahren können im Gegensatz zu kulturbasierten Verfahren bereits bei zirkulierender mikrobieller DNA („DNAämie“) sowie bei avitalen Mikroorganismen beziehungsweise solchen im VBNC (viable-but-nonculturable)-Status positiv ausfallen. Während dies im Falle von Kontaminationen von Nachteil sein kann, könnte dieser Aspekt bei antibiotisch vorbehandelten Erregern zu verbesserter Sensitivität führen

Von ihrem Spektrum erfassen marktverfügbare molekulare Testverfahren zum direkten Erregernachweis aus dem Vollblut in unterschiedlichem Ausmaß bakterielle und fungale Erreger von Blutstrominfektionen sowie teilweise auch Markergene für einige multiresistente Erreger (26, 27, e48). Diese als Multiplex-PCR konzipierten Systeme zum spezifischen Erregernachweis sind auf die häufigsten Erreger von Blutstrominfektionen beschränkt (je nach Testsystem circa 25–90 Erreger) und liefern bei selteneren Erregern falsch-negative Ergebnisse. Für koagulasenegative Staphylokokken und nichthämolysierende Streptokokken, die auch Hautmikrobiota-Kontaminanten darstellen können, wurden teilweise erniedrigte Schwellenwerte zur artifiziellen Sensitivitätsabsenkung eingeführt. Diese können bei entsprechend vulnerablen Patientengruppen (zum Beispiel neutropenische Patienten und Frühgeborene) zur Untererfassung von infektionsassoziierten Bakteriämien mit diesen Erregern führen (28).

Die speziesübergreifenden PCR-Verfahren benötigen zusätzliche Zeit für die Amplifikatanalyse. Sie sind nicht auf einzelne Erreger limitiert und ermöglichen auch die Identifizierung mittels Blutkultur nicht oder nur schwierig kultivierbarer Erreger, zum Beispiel von Tropheryma whipplei, Bartonellen, Mykobakterien oder Schimmelpilzen. Indiziert sind sie auch für solche Situationen, in denen ihr im Vergleich zur kulturbasierten Diagnostik schnelleres Testergebnis einen Vorteil für die Therapie oder Prävention von Infektionen bietet.

In den letzten Jahren erschien eine Vielzahl von Publikationen, die die Übereinstimmung der PCR-Identifizierungsergebnisse mit kulturellen Verfahren zum Gegenstand hatten (27, 2931, e49e52). Frühe Studien zum klinischen Nutzen beschränkten sich auf Daten aus retrospektiven Auswertungen (3234, e50, e53) beziehungsweise prospektiven, aber nicht randomisierten Studien (3537). In den zwei ersten randomisierten kontrollierten Studien wurde der klinische Nutzen direkter Multiplex-PCR aus Vollblut untersucht (38, 39). Bei hämatologischen Patienten mit febriler Neutropenie betrug die mediane Zeit bis zur Umstellung auf eine gezielte antimikrobielle Therapie in der Studiengruppe (Multiplex-PCR zusätzlich zu Blutkulturen) 21,4 Stunden im Vergleich zu 42,5 Stunden in der Kontrollgruppe (nur Blutkulturen); p = 0,018 (38). Ein positiver PCR-Befund führte in 33 % zu einer Therapieumstellung. Bei septischen Intensivpatienten zeigte eine weitere Studie eine signifikant reduzierte Zeit bis zur Ergebnismitteilung durch die zusätzliche Verwendung einer Multiplex-PCR aus Vollblut (15,9 Stunden nach der Probenentnahme) im Vergleich zu alleiniger Blutkulturdiagnostik (38,1 Stunden) (39). Die mittlere Zeit zwischen Blutentnahme und Umstellung von kalkulierter auf eine gezielte antimikrobielle Therapie betrug 18,8 Stunden in der Studiengruppe im Vergleich zu 38,3 Stunden in der Kontrollgruppe.

Moderne NAT-Verfahren können mit hoher diagnostischer Güte zum schnelleren Erregernachweis und damit zur frühzeitigeren Applikation einer gezielten Erregertherapie führen. Beim Verdacht auf schwierig oder nicht kultivierbare Erreger können – neben den hier nicht diskutierten Antikörpernachweis-Verfahren – speziesübergreifende NAT-Verfahren zur Identifizierung beitragen. Verschiedene Limitationen haben jedoch einer breiteren Anwendung der NAT-Verfahren außerhalb eines Studiensettings entgegengewirkt (Kasten 2). Hauptnachteile sind fehlende Aussagen zum Antibiotika-Resistenzphänotyp und fehlende Möglichkeiten zur weiteren Isolatcharakterisierung. Es wird versucht, den Sensitivitätsproblemen der NAT-Verfahren zum Beispiel durch selektive Konzentration mikrobieller DNA zu begegnen (e54).

Einschränkungen beim Einsatz von direkten Erregernachweisen aus Vollblut
Einschränkungen beim Einsatz von direkten Erregernachweisen aus Vollblut
Kasten 2
Einschränkungen beim Einsatz von direkten Erregernachweisen aus Vollblut

Antibiotika-Empfindlichkeitstestung und Resistenzgen-Nachweis

Obwohl bereits die Spezies-Identifizierung hilfreiche Informationen für therapeutische Entscheidungen liefern kann, sind die Ergebnisse der antimikrobiellen Empfindlichkeitstestung ausschlaggebend für die endgültige Wahl der gezielten Therapie. Daher gilt es bei kritischen Infektionen auch möglichst zeitnah Ergebnisse der Empfindlichkeitstestung zu generieren.

Konventionell werden Einzelkolonien von Festnährmedien zur Empfindlichkeitstestung eingesetzt. Für die Diagnostik von Blutstrominfektionen bedeutet das eine erhebliche Zeitverzögerung durch notwendige Bebrütungszeiten nach dem Ausstreichen positiv gemeldeter Blutkulturflaschen.

Beschleunigung der Empfindlichkeitstestung durch Änderung der Kultivierungsmethodik

Bei der direkten Inokulation von Testsystemen aus positiv gemeldeten Blutkulturflaschen wird nicht auf das Wachstum von subkultivierten Kolonien auf Festnährmedien gewartet. Durch Zentrifugation positiv gemeldeter Blutkulturflaschen gewonnene Zellpellets werden direkt für eine Inokulation in Empfindlichkeitstestungssysteme eingesetzt. Für Hefen wurde dadurch eine Ergebnisbeschleunigung von 15,1 Stunden erzielt (18). Während die Ergebnisse für gramnegative Stäbchenbakterien eine gute Übereinstimmung im Vergleich zur herkömmlichen Vorgehensweise zeigten, wurde für grampositive Kokken und Hefen jedoch keine ausreichend gute Ergebniskonkordanz erzielt (18, 40) (e55).

Eine elegante und kostengünstige Strategie basiert auf dem Einsatz der Biomasse kurzbebrüteter Subkulturen. Hierzu werden nur sehr kurz auf Festmedien zwischenbebrütete Subkulturen für die Empfindlichkeitstestung eingesetzt. Die Übereinstimmung mit der Standardtestung betrug hierbei über 99 % (25). Die mittleren Inkubationszeiten der Subkulturen bis zum Beginn der Empfindlichkeitstestung betrugen nur 3,8 beziehungsweise 2,4 Stunden für grampositive Kokken und gramnegative Stäbchenbakterien. Die Zeiteinsparung lag damit bei etwa einem Tag ohne zusätzlichen Kosten- beziehungsweise Arbeitsaufwand. Diese Vorgehensweise ist gut mit der schnellen Identifizierung mittels MALDI-TOF-MS aus kurz auf Festmedien bebrüteten Subkulturen kombinierbar (14).

Einsatz der MALDI-TOF-MS zum beschleunigten Nachweis von Resistenzen und zur Empfindlichkeitstestung

Die Vorteile der MALDI-TOF-MS hinsichtlich Zeitersparnis und einfacher Handhabung führten zu mehreren Ansätzen, diese Methodik auch für den Nachweis einzelner Resistenzmechanismen und aktuell auch als Alternative für die universelle Empfindlichkeitstestung zu adaptieren. So können antibiotikabedingte Veränderungen des Erregerproteoms zu Massenveränderungen führen, die dann mittels MALDI-TOF-MS nachweisbar werden (e56). Eine andere Herangehensweise beruht auf durch mikrobielle Resistenzmechanismen bedingte Massenveränderungen zugesetzter Antibiotika, zum Beispiel die Hydrolyse von Betalaktamantibiotika durch bakterielle Betalaktamasen (e57). Diese Methoden benötigen etwa 0,5–4 Stunden, sind aber auf einzelne Resistenzmechanismen beschränkt und bedingen zusätzlichen Testaufwand.

Eine neue Anwendung zum universellen Einsatz der MALDI-TOF-MS zur schnellen Empfindlichkeitstestung beruht auf der wachstumsbasierten Differenzierung in „empfindlich“ und „resistent“ – ähnlich wie in der konventionellen Empfindlichkeitstestung. Unter Einsatz von Breakpoint-Konzentrationen zugesetzter Antibiotika wird mittels MALDI-TOF-MS gemessen, ob mikrobielles Wachstum zu testender Isolate stattfindet (= resistent) oder nicht (= empfindlich) (e58). Aktuell wurde dieses Verfahren durch die Entwicklung einer Inkubation der zu testenden Isolate in Mikrotropfen direkt auf den MALDI-TOF-MS-Targets (DOT-MGA; „direct-on-target microdroplet growth assay“) weiter beschleunigt und vereinfacht (e59). Bei diesem in der Entwicklung befindlichen, potenziell routinetauglichen Verfahren konnten in einer Pilotstudie innerhalb von 4–5 Stunden Empfindlichkeitstestungen für mehrere Antibiotika mit vergleichbarer Sensitivität und Spezifität zum Routineverfahren durchgeführt werden (e59). Dieses Verfahren bietet zusätzlich den Vorteil der parallelen Identifizierung und Empfindlichkeitstestung in einem Testansatz und lässt sich auch für die Empfindlichkeitstestung direkt aus Blutkulturen einsetzen (e59, e60).

Direkte DNA-basierte Detektion von Resistenzgenen in Vollblutproben

Idealerweise könnte bei Monoinfektionen die direkt aus Vollblutproben isolierte mikrobielle DNA nicht nur zur Erregeridentifizierung, sondern parallel auch zum Nachweis von den die Antibiotikaresistenz determinierenden Genen beziehungsweise – wenn mutationsbedingt – entsprechenden DNA-Abschnitten eingesetzt werden. Die derzeitigen PCR-Multiplexsysteme stoßen jedoch bereits mit der Abdeckung der häufigsten Erreger von Blutstrominfektionen an technologische Grenzen, sodass entweder auf die molekulare Detektion von Resistenzen verzichtet wird oder nur einzelne Resistenz-Genotypen einbezogen werden. In letzterem Fall erfolgt deren Detektion entweder parallel in einem Ansatz oder in einer sich anschließenden PCR, wenn es in der Primär-PCR ein Hinweis auf einen entsprechenden Erreger gibt. Beispiele kommerzieller Testsysteme umfassen bisher den Nachweis der mecA/mecC-Gene als Hinweis auf Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA)-Isolate oder der vanA-/vanB-Gene für Hinweise auf Vancomycin-resistente Enterokokken (VRE).

Präanalytik, Standardisierung und Qualitätssicherung

Präanalytische Faktoren (eSupplement 1) (12, 38, e61, e62) sowie Aspekte der Standardisierung und Qualitätssicherung (eSupplement 2) besitzen einen erheblichen Einfluss auf die Ergebnisqualität der mikrobiologischen Diagnostik von Blutstrominfektionen (e63).

Resümee

Die moderne mikrobiologische Diagnostik von Blutstrominfektionen ist auf dem Weg, sich dem Zeitpunkt der klinischen Verdachtsdiagnose einer Blutstrominfektion zu nähern, ist aber immer noch davon entfernt, unmittelbaren Einfluss auf die antibiotische Initialtherapie zu haben. Die MALDI-TOF-MS kombiniert mit dem Einsatz kurzbebrüteter Festnährmedien, hat zu einer enormen Beschleunigung der Identifizierung und der Empfindlichkeitstestung beigetragen. PCR-basierte Schnellteste können bei erfolgloser Kultivierung von Erregern von Blutstrominfektionen hilfreich sein, die Kultur aber nicht ersetzen. Die Vorteile der neuen Technologien können nur wirksam werden, wenn die Präanalytik, Arbeitsabläufe und -zeiten und das Qualitätsmanagement optimal angepasst werden sowie wesentliche Indikationen und Limitationen der einzelnen diagnostischen Verfahren dem anfordernden Arzt auch bekannt sind.

Erregerdiagnostik
Die Relevanz einer schnellen Erregerdiagnostik ergibt sich aus der Erregervirulenz und der Existenz resistenter Erreger-Phänotypen und wirtsseitig aus der zunehmend infektionsgefährdeteren Patientenstruktur mit immer mehr älteren, multimorbiden, immunkompromittierten und/oder mit Fremdkörpern versehenen Patienten.

Polymerase-Kettenreaktion
Mit Entwicklung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) konnte der Erregernachweis beschleunigt und für schwierig oder nicht kultivierbare Erreger auch eine höhere Sensitivität und Spezifität erreicht werden.

PCR und Kulturverfahren
Je nach Indikation können beide diagnostischen Strategien in synergistischer Weise zu einer validen Erregeridentifizierung und Empfindlichkeitsbestimmung sowie zur weiteren Erregercharakterisierung beitragen.

MALDI-TOF-MS-Systeme
MALDI-TOF-MS-Systeme haben im Verlauf nur weniger Jahre in vielen Laboratorien die konventionelle Erregeridentifizierung mittels biochemischer Verfahren fast vollständig abgelöst und sind auf dem Weg, auch zur Antibiotikaempfindlichkeitstestung eingesetzt zu werden.

Spezifität der Nukleinsäureamplifikationstests (NAT)
Die NAT-Spezifität ist stark abhängig von der Auswahl der Zielstrukturen, der Primer- und Sondenkomposition und den PCR-/Microarray-Reaktionsbedingungen.

Auswertung der Befunde
Um bei den derzeitigen technologischen Innovationen Fehlinterpretationen vorzubeugen, ist es essenziell, dass deren Testergebnisse in den Kontext mit anderen Befunden gestellt und kritisch bewertet werden.

MALDI-TOF-Massenspektrometrie
Die Hauptvorteile der MALDI-TOF-Massenspektrometrie liegen in der extremen Schnelligkeit (Minuten) und Kostengünstigkeit einzelner Analysen bei hoher Spezifität.

Sepsisbedingte Mortalität
Die sepsisbedingte Mortalität kann deutlich gesenkt werden, wenn eine adäquate antimikrobielle Therapie frühzeitig initiiert wird. Für die Prognose ist die erste Stunde nach Einsetzen der Symptomatik entscheidend.

Qualifizierung des Befundes
Die Qualifizierung eines mikrobiologischen Befundes als kausativen Erreger von Blutstrominfektionen erfordert den klinischen Kontext und die Gesamtschau aller infektionsrelevanten Parameter.

Herkömmliche Diagnostik von Blutstrominfektionen

  • Inokulation des Patientenblutes in einem Flüssigmedium (Blutkulturflaschen) zur primären Erregeranzucht
  • nachfolgende Subkultivierung auf Festnährmedien
  • Identifizierung und Antibiotika-Empfindlichkeitstestung

Direkte Erregeridentifikation
Für eine direkte Erregeridentifikation aus positiv gemeldeten Blutkulturflaschen mittels MALDI-TOF-MS ist eine Probenaufbereitung durch vorgeschaltete Verfahren, wie das Lysis-Zentrifugation-Verfahren mit anschließender Ethanol-/Ameisensäure-Extraktion notwendig.

Hauchartiges Wachstum
Das mikrobielle Koloniematerial ist für die MALDI-TOF-MS-Analyse bereits nach Sichtbarwerden eines (hauchartigen) Wachstums auf einem Festnährmedium für ein verwertbares Analyseergebnis einsetzbar.

Direkte DNA-basierte Erregeridentifizierung aus Vollblut
Je nach Testsystem kann bei Multiplex-PCR-Systemen nach circa 3,5–8 Stunden ein Ergebnis vorliegen. Speziesübergreifende NAT-Testverfahren benötigen durch die erforderliche Sequenzierung des PCR-Amplifikats deutlich länger.

Speziesübergreifende PCR-Verfahren
Sie sind nicht auf einzelne Erreger limitiert und ermöglichen auch die Identifizierung mittels Blutkultur nicht oder nur schwierig kultivierbarer Erreger, wie zum Beispiel von Tropheryma whipplei, Bartonellen, Mykobakterien oder Schimmelpilzen.

Moderne NAT-Verfahren
Moderne NAT-Verfahren können mit hoher diagnostischer Güte zum schnelleren Erregernachweis und damit zur frühzeitigeren Applikation einer gezielten Erregertherapie führen.

Effizienz der beschleunigten Empfindlichkeitstestung
Während die Ergebnisse für gramnegative Stäbchenbakterien eine gute Übereinstimmung im Vergleich zur herkömmlichen Vorgehensweise zeigten, wurde für grampositive Kokken und Hefen keine ausreichend gute Ergebniskonkordanz erzielt.

Interessenkonflikt
Prof. Becker ist Miterfinder der Patentanmeldung „Aufbereitung lebendiger, mikrobieller Proben und Mikroorganismen für anschließende massenspektrometrische Messung und Auswertung“ sowie der Patentanmeldung „Vorrichtung und Verfahren zum Aufbereiten von Flüssigkeiten, insbesondere Körperflüssigkeiten“. Die Patentanmeldungen wurden von dem Universitätsklinikum Münster lizensiert und die Erfinderanteile wurden Prof. Becker laut Gesetz zugestellt. Er erhielt Vortragshonorare inklusive Reisekostenerstattung von Becton Dickinson, bioMérieux, Bruker, Daltonik, Hain, Lifescience, Roche Molecular Systems, ThermoFisher.

PD Idelevich ist Miterfinder der Patentanmeldung „Aufbereitung lebendiger, mikrobieller Proben und Mikroorganismen für anschließende massenspektrometrische Messung und Auswertung“ sowie der Patentanmeldung „Vorrichtung und Verfahren zum Aufbereiten von Flüssigkeiten, insbesondere Körperflüssigkeiten“. Die Patentanmeldungen wurden von dem Universitätsklinikum Münster lizensiert und die Erfinderanteile wurden PD Idelevich laut Gesetz zugestellt. Er erhielt Erstattung von Teilnahmegebühren sowie Reise- und Übernachtungskosten für einen Kongress von Astellas. Für Vortragstätigkeiten wurde er honoriert von Novartis, Pfizer und Bruker.

Prof. Reischl erklärt, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Manuskriptdaten
eingereicht: 4. 10. 2017, revidierte Fassung angenommen: 12. 10. 2018

Anschrift für die Verfasser
Prof. Dr. med. Karsten Becker

Institut für Medizinische Mikrobiologie

Universitätsklinikum Münster

Domagkstraße 10

48149 Münster

kbecker@uni-muenster.de

Zitierweise
Idelevich EA, Reischl U, Becker K: New microbiological techniques in the diagnosis of bloodstream infections.
Dtsch Arztebl Int 2018; 115: 822–32. DOI: 10.3238/arztebl.2018.0822

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Unterschiedlich lange bebrütete Enterobacter-cloacae-Kulturen auf einem Festnährmedium (Blutagarplatten) und ihr Einsatz in der Diagnostik
Unterschiedlich lange bebrütete Enterobacter-cloacae-Kulturen auf einem Festnährmedium (Blutagarplatten) und ihr Einsatz in der Diagnostik
Abbildung
Unterschiedlich lange bebrütete Enterobacter-cloacae-Kulturen auf einem Festnährmedium (Blutagarplatten) und ihr Einsatz in der Diagnostik
Gezielter und ungezielter Erregernachweis mittels DNA-basierter Methoden
Gezielter und ungezielter Erregernachweis mittels DNA-basierter Methoden
Grafik 1
Gezielter und ungezielter Erregernachweis mittels DNA-basierter Methoden
Prozesse und Zeiten
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Grafik 2
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Fragen zur Bewertung von NAT-Befunden
Fragen zur Bewertung von NAT-Befunden
Kasten 1
Fragen zur Bewertung von NAT-Befunden
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Einschränkungen beim Einsatz von direkten Erregernachweisen aus Vollblut
Kasten 2
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Avatar #105213
Ströbele
am Sonntag, 20. Januar 2019, 16:59

Kritik zu Fragen 6 und 7

Frage: Um zu verstehen, was das Akronym "MALDI-TOF" bedeutet, muss man das e-Supplement lesen, was für Nicht-Labormediziner und/oder Nicht-Mikrobiologen schon sehr weit ab vom eigentlichen Berufsbild und Interessensgebiet sein dürfte. (Bin FÄ für Allgemeinmedizin.) Nukleinsäuren sind sowohl DNA (Antwort A) als auch RNA (Antwort B), somit ist nicht eindeutig wqs die richtige Antwort sein soll.
Frage 7: es wird nach "Organismen" gefragt, bei a) und e) jedoch "Prionproteine" bzw. "transfer RNA" als Antworten angeboten, was eher keine "Organismen" im eigentlichen Sinne sind. Auch ob C) und D) "Viren" wirklcijh<orgasnsiomen sind, lässt sich streiten. Die Frage ist also "geschenkt", eigentlich KANN nur b) richtig sein.
Avatar #758673
Karsten Becker
am Donnerstag, 10. Januar 2019, 18:30

Antwort zu: "Nicht etwa Schwellenwerte erhöht um Sensivität zu senken?"

Der Begriff "Schwellenwerte" bezieht sich hier auf die "number of amplification cycles until positivity" und wie in der zitierten Publikation bemerkt: "The integrated cutoff for CoNS by the SeptiFast Identification Software (SIS) automatically omitted CoNS results if they occurred after 20 of the overall 30 amplification cycles." Dadurch, dass dieser von 30 auf 20 Zyklen erniedrigte Schwellenwert zur Anzahl der Amplifikationszyklen bis zur Kategorisierung als "positiv" eingeführt wurde, sinkt (artifiziell) die Sensitivität.
Avatar #77316
alexanes
am Mittwoch, 2. Januar 2019, 17:41

Nicht etwa Schwellenwerte erhöht um Sensivität zu senken?

"Für koagulasenegative Staphylokokken und nichthämolysierende Streptokokken, die auch Hautmikrobiota-Kontaminanten darstellen können, wurden teilweise erniedrigte Schwellenwerte zur artifiziellen Sensitivitätsabsenkung eingeführt. "
Müssten es nicht erhöhte Schwellenwerte sein, um die Sensitivität abzusenken?
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