Die „Knockout“-Maus als Krankheitsmodell: Prinzipien und klinische Relevanz

Neue Einblicke in die molekulare Pathogenese zahlreicher Erkrankungen beeinflussen in vielfältiger Weise Krankheitsverständnis und ärztliches Handeln. Für den Arzt gewinnt ein grundlegendes Verständnis wichtiger molekulargenetischer Methoden zunehmend an Bedeutung. Die folgende Arbeit will hierzu einen Beitrag leisten, indem sie einen methodologischen Überblick über eines der wichtigsten Verfahren der modernen Molekulargenetik zur Untersuchung von Genfunktionen in vivo gibt.

Die Untersuchung von Genfunktionen mittels gerichteter Mutagenese im Reagenzglas (in vitro) gehört seit längerem zum Standardrepertoire der Molekulargenetik. Aber erst aufgrund der raschen Entwicklung der embryonalen Stammzell(ES)-Technologie in den letzten Jahren wurde es möglich, gezielt Gene im intakten Tier (in vivo) zu inaktivieren (45). Mit Hilfe der daraus resultierenden "Knockout"-Mäuse lassen sich zahlreiche Krankheiten des Menschen in einem genetisch definierten Kleintiermodell nachahmen, das schnell und in großer Zahl verfügbar ist. Das hohe Maß an Reproduzierbarkeit dieser Modellsysteme gestattet es, die oftmals unvermeidlichen Unwägbarkeiten klinischer Beobachtungen infolge der niedrigen Frequenz natürlich auftretender Mutationen zu vermeiden.
Die vorliegende Arbeit hat zwei Ziele. Erstens sollen die grundlegenden Prinzipien der "Knockout"Technologie allgemeinverständlich dargestellt werden. Dem Interessierten wird damit ein Grundwissen für Verständnis und informierte Beurteilung der zahlreichen mit Hilfe von "Knockout"-Tieren gewonnenen Daten angeboten. Zweitens wird auf die medizinische Relevanz der "Knockout"-Maus anhand von konkreten Beispielen hingewiesen.

"Knockout"-Mäuse: Das Prinzip
Säugerzellen besitzen die Fähigkeit, identische DNA-Bereiche zwischen homologen Chromosomen wechselseitig auszutauschen. Dies wird als homologe Rekombination bezeichnet und dient beispielsweise der Neukombination des Erbgutes während der Meiose. Homologe Rekombination findet aber nicht nur zwischen Chromosomenpaaren, sondern auch zwischen einem Chromosom und einem rekombinanten DNA-Molekül (Vektor) statt, welches künstlich in die Zelle eingebracht wurde. Voraussetzung ist lediglich, daß der Vektor dem Chromosom homologe DNA-Regionen enthält. Dieser Mechanismus wurde für die gezielte Geninaktivierung in Säugerzellen adaptiert (5,41).
Ausgangspunkt der Geninaktivierung ist die Herstellung eines Inaktivierungsvektors (Grafik 1a). Dieser enthält zwei benachbarte DNA-Bereiche des zu inaktivierenden Zielgens, welche durch ein positiv selektierbares Gen getrennt sind. Typischerweise ist dies ein Gen, dessen Produkt Resistenz gegen Aminoglykosid-Antibiotika verleiht. Der Inaktivierungsvektor wird in Säugerzellkulturen eingebracht und durch Gabe von Antibiotika diejenigen Zellen angereichert, welche den Vektor aufgenommen und damit die Antibiotikaresistenz erworben haben. In diesen Zellen kommt es durch homologe Rekombination zu einem wechselseitigen Austausch der Genbereiche des Vektors und des chromosomalen Genortes (Wildtyp-Gen). Analog zur Wirkungsweise des Trojanischen Pferdes werden dabei nicht nur zwei Vektor-Genfragmente, sondern auch das dazwischenliegende Selektionsgen in das Chromosom eingeführt. Dies führt zu einer zerstörten Abfolge der genetischen Information des Zielgens (Defekt-Gen). Da die Inaktivierung normalerweise nur eines der beiden Allele betrifft, sind die Zellen heterozygot für den Gendefekt. Die Möglichkeit, den in Gewebekultur herbeigeführten Gendefekt in ein Tier zu übertragen, kam mit der Beobachtung, daß pluripotente embryonale Stammzellen (ES-Zellen) aus Mausembryonen isoliert und in Zellkultur vermehrt werden können. Werden diese ES-Zellen wieder in Mausembryonen im Blastozystenstadium injiziert, so integrieren sie sich in die embryonale Zellmasse und tragen zum Aufbau aller Gewebe einschließlich der Keimbahn bei (12, 30, 32). Dies ermöglicht es, ein Geninaktivierungsexperiment in ES-Zellkulturen durchzuführen und den Gendefekt über die Stammzellen in die Keimbahn von Mäusen einzubringen. Hierzu wird der Inaktivierungsvektor in ES-Zellen eingebracht und durch Antibiotika-Selektion werden Zellen angereichert, welche das Defekt-Gen tragen (Grafik 1b). Diese Zellen werden vermehrt und in Blastozysten injiziert. Nach Transfer in Empfängermäuse entwickeln sich die Embryonen zu Tieren, deren Gewebe aus einer Mischung von Zellen der Blastozyste und der genetisch veränderten ES-Zellen bestehen (Chimäre). Der Anteil beider Zelltypen an der Chimäre läßt sich an der Fellfärbung abschätzen, da die Blastozysten aus einem Mausstamm mit schwarzer Fellfarbe (C57BL/6J Maus), die ES-Zellen dagegen aus einem Stamm mit brauner Färbung (Agouti-Maus) gewonnen werden. In gleichem Verhältnis, in dem braune und schwarze Flecken das Fell ausbilden, sind beide Zelltypen auch in allen anderen Geweben einschließlich der Keimbahn vertreten (Grafik 1c). Um nun Tiere zu erhalten, welche ausschließlich Körperzellen mit heterozygotem Gendefekt tragen, wird die Chimäre mit einer C57BL/6J Maus gekreuzt (Grafik 1b). Alle Nachkommen, welche das Erbgut der genetisch veränderten ES-Zellen tragen, weisen eine braune (Agouti-)Fellfarbe auf. Tiere mit dem Erbgut der Blastozyste dagegen sind schwarz. In den Agouti-Tieren erfolgt der genetische Nachweis des Defekt-Gens. Die heterozygoten Tiere können dann miteinander gekreuzt werden, um homozygot-defiziente ("Knockout"-)Mäuse zu erhalten.

Klinische Korrelationen

Atherosklerose und familiäre Hypercholesterinämie
Bei der familiären Hypercholesterinämie (FH) führen Mutationen im Gen des Rezeptors für low density lipoproteins (LDLR) zu einer reduzierten Aufnahme von Apolipoprotein (Apo) B-100 und/oder ApoE enthaltenden cholesterolreichen Lipoproteinen aus dem Plasma (3). LDL akkumuliert im Plasma und wird schließlich in verschiedenen Geweben abgelagert (14). Von besonderer klinischer Relevanz sind Depositionen in den Gefäßwänden der Koronarien, die über eine Lumeneinengung zu vorzeitiger koronarer Herzerkrankung (KHK) führen. Genetisch ist die FH durch einen autosomal-dominanten Erbgang charakterisiert. Mit einer Frequenz von etwa 1:500 (Heterozygote) zählt sie zu den häufigsten angeborenen Stoffwechselerkrankungen des Menschen.
Unter Anwendung der in Grafik 1 dargestellten Technik wurden Mäuse mit LDLR-Gendefekt hergestellt (LDLR-"Knockout"-Mäuse; abgekürzt: LDLR-/-) (20). Unter einer mäßig cholesterolhaltigen Diät traten bei den LDLR-/-Mäusen im Vergleich zu Wildtypmäusen zweifach erhöhte PlasmaGesamtcholesterolspiegel auf. Wie die Auftrennung der Plasma-Lipoproteine in die Subfraktionen zeigt, ist diese Erhöhung im wesentlichen auf einen Anstieg der Apo-B-100 und ApoE enthaltenden intermediate density lipoproteins (IDL) sowie der ausschließlich Apo-B-100 enthaltenden LDL zurückzuführen (Grafik 2 b). Dieser Befund ließ sich unter fettreicher Nahrung, die in ihrer Zusammensetzung derjenigen in westlichen Industrienationen ähnelt, noch verstärken (21). Nach sieben Monaten unter dieser atherogenen Nahrung zeigten die LDLR-/-Mäuse die für die FH charakteristischen Cholesterolablagerungen in verschiedenen Geweben, unter anderem auch Xanthome und Xanthelasmen. Aorta und koronare Ostien wiesen grobe atheromatöse Läsionen auf, und sogar in den Hauptstämmen der Pulmonalarterien ließen sich regelmäßig atheromatöse Plaques nachweisen (21).
ApoE ist eines der zehn menschlichen Plasma-Apolipoproteine, die Teil der Hüllschicht von LipoproteinKomplexen sind. ApoE ist entscheidend an der hepatischen Aufnahme von cholesterolreichen ChylomikronenResten und VLDL-Resten ("remnants") beteiligt. Das 34 kDa schwere Glykoprotein existiert in drei kodominant vererbten Allelen (E2, E3 und E4). Epidemiologische Studien konnten zeigen, daß bestimmte ApoE-Phänotypen mit einer erhöhten Atherosklerose-Erkrankungswahrscheinlichkeit einhergehen (17). Der E2/2-Phänotyp führt beispielsweise zu einer gestörten postprandialen Lipoproteinclearance infolge niedriger Bindungsaffinität des ApoE2 für Lipoproteinrezeptoren (48). Jeder fünfzigste E2/2-Homozygote entwickelt eine Typ-III-Hyperlipoproteinämie, die klinisch durch vorzeitig auftretende, massiv ausgeprägte Atherosklerose sowie KHK gekennzeichnet ist.
Zwei Arbeitsgruppen erzeugten unabhängig voneinander ApoE-defiziente Mäuse unter Verwendung der "Knockout"-Technik (36, 51). ApoE-defiziente Mäuse entwickelten spontan unter normaler, fett- und cholesterolarmer Nahrung regelmäßig fortgeschrittene atherosklerotische Läsionen, die histologisch denjenigen im Menschen glichen. Homozygot ApoE- defiziente Mäuse entwickeln ferner, wie erwartet, eine schwere Hypercholesterinämie infolge der gestörten rezeptorvermittelten Aufnahme von IDL und ChylomikronenResten (CR) aus dem Plasma, die auf ApoE angewiesen ist (Grafik 2 c). Dieser Befund entspricht den Lipoproteinveränderungen im Plasma von Patienten mit Typ-III-Hyperlipoproteinämie.
Welche Relevanz haben diese Mausmodelle für das Verständnis menschlicher Erkrankungen? Obwohl sowohl ein kompletter Mangel an ApoE (13, 25, 28) als auch Mutationen im ApoE-Gen des Menschen (29) schon bekannt waren, eröffnet die "Knockout"-Maus zahlreiche neue Möglichkeiten, den Einfluß endogener (Gene) und exogener (Umwelt-) Faktoren auf die Ausbildung atherosklerotischer Läsionen in vivo reproduzierbar zu überprüfen (Tabelle 1). ApoE-/-Tiere können beispielsweise mit Mäusen gekreuzt werden, in denen potentiell proatherogene Gene – wie das Gen für Cystathionin b-Synthase oder Adhäsionsmoleküle wie P-Selectin – ebenfalls gezielt inaktiviert wurden (31, 46). Eventuell resultieren aus Kreuzungen der ApoE-/-Mäuse mit anderen genetisch modifizierten Tieren auch Nachkommen, deren Plasma-Cholesterolspiegel trotz fettreicher Nahrung nicht ansteigen. In diesen Tieren lassen sich die Auswirkungen der zusätzlichen genetischen Veränderung auf Krankheitshäufigkeit und -verlauf untersuchen und mittels Kopplungsanalysen ("link-age analysis") diejenigen Genorte identifizieren, welche modulierend in den Lipidstoffwechsel eingreifen. Derartige Studien liefern möglicherweise Antworten auf die aus der klinischen Beobachtung resultierende Frage, warum das Ausmaß atherosklerotischer Läsionen trotz vergleichbarer Plasma-Cholesterolspiegel von Mensch zu Mensch stark variieren kann. Auch neue Therapiestrategien lassen sich in den "Knockout"-Tieren überprüfen. Im Bereich konventioneller Therapieansätze können die metabolischen Auswirkungen von Medikamenten mit neuartigem Wirkmechanismus (zum Beispiel Antioxidantien oder Lipidsenker) in vivo getestet werden. Darüber hinaus sind diese Tiere auch für die Entwicklung innovativer Therapien von großem Nutzen. So führte die Transplantation von Knochenmark aus ApoE-Wildtypmäusen in ApoE-/-Mäuse nach vier Wochen zu einer Senkung der mittleren Plasma-Cholesterolspiegel um 74 Prozent auf fast normale Werte, obwohl die behandelten Tiere zu diesem Zeitpunkt lediglich 12,5 Prozent der normalen Serum-ApoE-Konzentrationen aufwiesen (27). Diese Studie zeigt exemplarisch, daß extrahepatisch (am wahrscheinlichsten von Makrophagen) synthetisiertes ApoE in vivo bereits in relativ niedrigen Konzentrationen die Ausbildung atherosklerotischer Läsionen signifikant reduzieren kann. In anderen Experimenten wurde die pathophysiologische Rolle von HDL, dessen Plasmakonzentration invers mit dem Atheroskleroserisiko korreliert, genauer untersucht (35, 39). Transgene Mäuse, die das Hauptprotein von HDL (ApoA-I1) überexprimieren und daher signifikant erhöhte HDL-Plasmakonzentrationen aufweisen, wurden mit den ApoE/-Mäusen gekreuzt. Doppelt transgene Tiere hatten zwei- bis dreifach erhöhte ApoA-I1-Konzentrationen und wiesen trotz kompletter ApoE-Defizienz eine hochsignifikante Reduktion der Inzidenz und Größe atherosklerotischer Läsionen auf. Die ApoE/ApoA-I1-Studien verdeutlichen unter anderem den potentiellen Nutzen einer Erhöhung von Apolipoproteinen für die zukünftige Primär- und Sekundärprävention der Atherosklerose.
Realisierbarkeit, Effizienz und Sicherheit geplanter Ansätze zur somatischen Gentherapie lassen sich vor Einsatz am Menschen in "Knockout"-Mäusen demonstrieren (4, 15, 16). Im Fall der FH wurden Hepatozyten von LDLR-/-Mäusen in vivo einmalig mit rekombinanten Adenoviren infiziert, welche die intakte genetische Information des menschlichen LDLR enthielten (20). Die viral übertragenen Rezeptoren waren in vivo funktionell aktiv und führten über einen Zeitraum von bis zu einer Woche nach Virusapplikation zu einer signifikanten Reduktion der Plasma-Cholesterolspiegel durch rezeptorvermittelte hepatische Aufnahme der Plasmalipoproteine.

Endothelin "Knockout"-Mäuse
Das Gefäßendothel kann als größtes endokrines Organ des menschlichen Körpers angesehen werden, dessen mehr als eine Trillion Endothelzellen in einem 70 Kilogramm schweren Erwachsenen eine Fläche von mindestens 1000 m2 bedecken und eine Familie biologisch hochpotenter, aus 21 Aminosäuren bestehender Peptide sezernieren (23, 50). Das erste Mitglied dieser Peptidfamilie, Endothelin (ET)-1, wurde 1988 isoliert und erwies sich als einer der potentesten Vasokonstriktoren überhaupt (50). Bisher sind drei Mitglieder der Endothelin-Familie identifiziert worden, ET-1, -2 und -3, die an zwei G-Protein gekoppelte Rezeptor-Subtypen, Endothelin-A (ETA) und Endothelin-B (ETB), binden (Grafik 3 a). Endotheline werden, ebenso wie ihre Rezeptoren, in einer Vielzahl vaskulärer und nicht-vaskulärer Gewebe exprimiert (19). Seit ihrer Entdeckung haben sich zahlreiche Hinweise auf eine Beteiligung der Endotheline an diversen gefäßpathologischen Prozessen ergeben (Tabelle 2). Um die biologische Funktion der Endotheline in vivo zu testen, wurden Defekte in Gene des ETB-Rezeptors (18) oder ET-3 (1) eingeführt (Grafik 3 b und c). Die Phänotypen der resultierenden "Knockout"-Mäuse waren vollkommen unerwartet und weisen auf neue biologische Funktionen dieser Peptide in vivo hin (1, 18).
ETB-Rezeptor-/-Tiere (Grafik 3 b) entwickeln zwei interessante Phänotypen, die auch spontan in verschiedenen anderen Spezies auftreten können:
À Weißgeflecktes Fell und
Á spastisches distales Kolon mit massiver Distension der unmittelbar proximal gelegenen Darmabschnitte. Die mikroskopische Untersuchung der weißfleckigen Hautareale ergab das vollständige Fehlen von epidermalen Melanozyten. Die betroffenen distalen Darmregionen zeichneten sich histologisch durch das Fehlen des Plexus myentericus (Auerbach) und submucosus (Meissner) aus. Beide Befunde sind vereinbar mit einem Entwicklungsdefekt der vom Neuralrohr abstammenden epidermalen Melanozyten und intestinalen Ganglienzellen. Die Mäuse wiesen somit die pathophysiologischen Korrelate zum menschlichen M. Hirschsprung auf. Aufgrund der Ergebnisse des ETB-Rezeptor-"Knockouts" wurde folgende Hypothese formuliert: Mutationen im menschlichen ETB-Rezeptor-Gen sind für eine erbliche Form des genetisch heterogenen M. Hirschsprung verantwortlich. Kürzlich wurde diese erbliche Form des M. Hirschsprung auf dem menschlichen Chromosom 13q22 lokalisiert, wo sich auch das ETB-Rezeptor-Gen befindet (38). Tatsächlich gelang dann auch der Nachweis einer Mutation in Exon 4 des menschlichen ETB-Rezeptor-Gens, die zu einer Störung der intrazellulären Signaltransduktion führt (37). Durch gezielte Inaktivierung des Gens für ET-3 (Grafik 3 c) wurden ferner "Knockout"-Mäuse erzeugt, die den vom ETB-Rezeptor "Knockout" bereits bekannten Phänotyp (weißgeflecktes Fell/aganglionäres Megakolon) reproduzierten (1). Somit war ET-3 als biologisch wirksamer Ligand des ETB-Rezeptors identifiziert.
Das Beispiel der ETB-Rezeptor/ET-3-defizienten Mäuse veranschaulicht, wie durch Anwendung der "Knockout"-Technologie neue Erkenntnisse über die biologische Funktion von Proteinen gewonnen werden können. Darüber hinaus führten die Experimente in der Maus zur Aufdeckung der molekularen Ursache einer menschlichen Erkrankung. Diese Daten ermöglichen die Entwicklung molekularer Testverfahren zur Identifizierung noch nicht erkrankter Träger des Defekt-Gens, die so engmaschig klinisch überwacht und bei Bedarf frühzeitig therapiert werden können.

Fazit
Die gezielte Geninaktivierung mittels homologer Rekombination in ES-Zellen stellt eine elegante und hilfreiche Technik dar, die neben der Analyse entwicklungsbiologischer und physiologischer Fragestellungen auch die Herstellung von Tiermodellen menschlicher Erkrankungen ermöglicht. Sie hat sich daher rasch zu einem wichtigen Bereich der medizinischen Forschung entwickelt. Die molekulargenetischen Methoden zur Herstellung der "Knockout"-Tiere sind, ebenso wie die durch ihre Anwendung erzielten Ergebnisse, oftmals fächerübergreifender Natur.
Daher sind bislang häufig als rein basiswissenschaftliches Spezialwissen geltende Kenntnisse für Ärzte der verschiedensten Disziplinen von Relevanz für Krankheitsverständnis und klinische Entscheidungsfindung.

Zitierweise dieses Beitrags:
Dt Ärztebl 1996; 93: A-1765–1769 [Heft 26]
Die Zahlen in Klammern beziehen sich auf das Literaturverzeichnis im Sonderdruck, anzufordern über die Verfasser.

Anschrift für die Verfasser:
Dr. med. Jürgen R. Braun
Berufsgenossenschaftliche Kliniken Bergmannsheil, Universitätsklinik
Medizinische Klinik
Bürkle-de-la-Camp-Platz 1
44789 Bochum

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