ArchivDeutsches Ärzteblatt17/2020SARS-CoV-2: Der richtige Nachweis
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Die Detektion von SARS-CoV-2-Nukleinsäure mittels Real-Time-PCR ist aktuell der Goldstandard zum Nachweis einer akuten Infektion mit dem Erreger. Zunehmend steigt aber auch das Interesse an Antikörpertests, von denen man sich Informationen über den Immunitätsstatus erhofft.

Die ersten Sequenzierungsdaten des neuartigen Coronavirus SARS-CoV-2 wurden zügig veröffentlicht, sodass universell einsetzbare, spezifische PCR-Protokolle bereits Anfang Januar 2020 etabliert werden konnten – zunächst als Inhouse-Testverfahren. Im Untersuchungslabor benötigen die Probenaufbereitung, die Extraktion der Nukleinsäure und die anschließende Reverse-Transkriptase- (RT-)PCR etwa 3–5 Stunden, weshalb die Testung in der Regel in Batches erfolgt. Dabei werden mehrere Proben in einem Untersuchungslauf getestet.

ELISA-basierte Testverfahren eignen sich zum Nachweis von Antikörpern gegen SARSCoV- 2 – ermöglichen allerdings (noch) keinen Immunitätsnachweis. Foto: picture alliance/Sven Hoppe/dpa
ELISA-basierte Testverfahren eignen sich zum Nachweis von Antikörpern gegen SARSCoV- 2 – ermöglichen allerdings (noch) keinen Immunitätsnachweis. Foto: picture alliance/Sven Hoppe/dpa

Zusätzlich zu den von den Laboren selbst entwickelten Testverfahren wurden mittlerweile zahlreiche CE-zertifizierte Testsysteme auf den Markt gebracht und das Angebot der kommerziellen Anbieter wächst stetig. Dabei werden verschiedene Zielsequenzen (E-Gen, N-Gen, Orf-Gen, M-Gen) des SARS-CoV-2 und unterschiedliche Auswertealgorithmen verwendet. Zur Untersuchung größerer Probenmengen existieren seit Kurzem auch PCR-Hochdurchsatz-Vollautomaten. Diese ermöglichen die Testung mehrerer Tausend Proben am Tag (1).

Gelegentlich Probleme bereitet das wiederholte Testen nach durchgemachter Erkrankung. In Einzelfällen kann bei klinisch Gesundeten über einen längeren Zeitraum SARS-CoV-2-spezifische Nukleinsäure in geringer Menge nachgewiesen werden. Aussagen über eine potenzielle Infektiosität lassen sich daraus jedoch (noch) nicht ableiten.

Es gibt Vermutungen, dass es sich dabei um „Nukleinsäuretrümmer“ nicht (mehr) intakter Viren handelt. Auch über eine mögliche Reaktivierung oder Reinfektion nach negativem PCR-Testergebnis und die empfohlenen Testabstände wird derzeit diskutiert. Sie sind Gegenstand aktueller Untersuchungen.

Patientennahe Testung

Für die Point-of-Care-Labordiagnostik sind kompakte Testsysteme auf Basis von Nukleinsäureamplifikationstechniken (NAT) bereits verfügbar oder in Entwicklung. Analoge Kartuschentests sind seit einigen Jahren zum Nachweis von Influenzaviren, des Humanen Respiratorischen Synzytial-Virus (HRSV) und anderer Erreger im klinischen Alltag und Labor etabliert.

Das für den Test zugelassene Untersuchungsmaterial wird hierzu in eine spezielle Testkartusche gegeben. In dieser sind alle für die Testdurchführung benötigten Komponenten und Reagenzien bereits enthalten. Die Reaktionsabläufe erfolgen als isothermale Prozesse oder nach dem PCR-Prinzip und inkludieren die Extraktion, die reverse Transkription der viralen RNA und die Amplifikation und Detektion. Dabei werden als Zielsequenz das Envelope-(E-) und das N-Gen des SARS-CoV-2 verwendet.

Diese kommerziell vertriebenen Testsysteme liefern teils bereits in unter einer Stunde ein Testergebnis. Sie setzen – mit Ausnahme der Beachtung des Mitarbeiterschutzes bei der Aufbereitung – nur eine begrenzte technische Expertise voraus. Ein Einsatz dieser Systeme bietet sich vor allem in den zentralen Notaufnahmen von Krankenhäusern an, neben der Notfalldiagnostik, um eine schnelle Isolation der Patienten zu ermöglichen.

Nachweis von Antikörpern

Zum Nachweis einer durchgemachten SARS-CoV-2-Infektion – und letztlich auch zur Ermittlung der SARS-CoV-2-Seroprävalenz und damit zur Abschätzung der Herdenimmunität – stehen für den serologischen Nachweis von Antikörpern gegen SARS-CoV-2 verschiedene Testsysteme zur Verfügung. Neben Inhousetests der Labore sind inzwischen zahlreiche (nur zum Teil) CE-zertifizierte Testsysteme erhältlich, darunter ELISA-basierte Verfahren, immunochromatografische Lateral-Flow-Kassettentests und Immunfluoreszenztests.

Je nach verwendetem Test können Antikörper der Klassen IgA, IgM und IgG, welche gegen Strukturproteine (S1- und/oder S2-Domäne des S-Proteins bzw. gegen das N-Protein) von SARS-CoV-2 gerichtet sind, differenziert werden. Sie ermöglichen eine qualitative beziehungsweise semiquantitative Aussage bezüglich eventuell vorhandener Antikörper.

Erste Hinweise deuten darauf hin, dass bei einer Infektion mit SARS-CoV-2 innerhalb oder sogar erst am Ende der zweiten Krankheitswoche IgG-spezifische Antikörper nachgewiesen werden können sowie gegebenenfalls bereits Antikörper vom Typ IgM und IgA einige Tage früher. Der alleinige Antikörpernachweis eignet sich daher nur sehr eingeschränkt zum Nachweis einer Infektion, insbesondere nicht zur Akutdiagnostik.

Problematisch ist auch die Tatsache, dass die Tests zum Teil eine gewisse Kreuzreaktivität gegenüber endemisch zirkulierenden (Beta-)Coronaviren (z. B. HCoV-OC43, HCoV-HKU1) oder anderen Infektionskrankheiten aufweisen (können) und somit die Möglichkeit falsch positiver Ergebnisse beinhalten. Diese teils eingeschränkte Spezifität könnte dazu führen, dass sich Personen, die positiv auf SARS-CoV-2-Antikörper getestet wurden, hinsichtlich ihrer Nichtinfizierbarkeit in einer falschen Sicherheit wähnen.

Die Sensitivität der Tests variiert unter anderem in Abhängigkeit vom Zeitpunkt ihres Einsatzes nach Symptombeginn. In einer aktuellen Studie wird die Sensitivität des IgM-Nachweises in der frühen Phase der Infektion (Tag 1–7) mittels ELISA-basierten Verfahren mit < 30 %, im weiteren Verlauf der Infektion (Tag 8–14) mit etwa 75 % angegeben, während die des IgG-Nachweises mit knapp 55 % deklariert wird. In der dritten Woche nach Symptombeginn (Tag 15–39) wird die Sensitivität für IgM mit > 94 % und für IgG mit knapp 80 % angegeben (2). In Abhängigkeit vom untersuchten Testsystem werden zum Teil jedoch auch Sensitivitäten und Spezifitäten von knapp 100 % angegeben (3, 4).

In der Handhabung am einfachsten sind Kassettentests – auch Schnelltests genannt. Manche dieser Tests liefern bereits 15 Minuten nach Zugabe von zugelassenem Untersuchungsmaterial (Serum/Plasma/Vollblut) und Pufferlösung ein qualitatives Ergebnis bezüglich eventuell vorhandener IgM- und/oder IgG-Antikörper. Sie eignen sich eingeschränkt für die rasche, patientennahe Diagnostik.

ELISA-Testsysteme finden in der Regel in infektionsserologischen Untersuchungslaboratorien Verwendung und weisen eine höhere Sensitivität und Spezifität als die Schnelltests auf. Sie basieren auf (meist rekombinant hergestelltem) SARS-CoV-2-Antigen-beschichteten Mikrotiterplatten und benötigen eine entsprechende Erfahrung bei der Durchführung. Neben mehreren Inkubations- und Waschschritten werden Kontrollen mitgeführt und ein Fotometer zur Auswertung benötigt. Die Tests erlauben eine semiquantitative Aussage bezüglich vorhandener IgG-, IgA- und IgM-Antikörper und eignen sich für die parallele Abarbeitung mehrerer Untersuchungsproben. ELISA oder ähnliche Tests sind (halb)automatisierbar. Inzwischen sind auch vollautomatische Testsysteme auf dem Markt beziehungsweise stehen unmittelbar vor der Markteinführung.

Für spezielle Fragestellungen kann der indirekte Immunfluoreszenztest eingesetzt werden. Bei diesem arbeitsaufwendigen Testverfahren werden SARS-CoV-2-Antigen-exprimierende Zellen auf einem Objektträger mit Patientenserum und einem fluoreszenzmarkierten Anti-human-Antikörper inkubiert. Anschließend wird das Präparat mittels Immunfluoreszenzmikroskopie untersucht. Je nach verwendetem Konjugat lassen sich IgG-, IgM- oder IgA-Antikörper nachweisen. Das Testergebnis ist jedoch abhängig von der Erfahrung und der subjektiven Einschätzung des Untersuchers.

Abschließend lässt sich zusammenfassen, dass der alleinige Nachweis von SARS-CoV-2-spezifischen Antikörpern in der Frühphase der Infektion keine beweisende, jedoch gegebenenfalls eine orientierende Aussage bezüglich einer COVID-19-Erkrankung liefern kann, welche durch molekularbiologische Nachweismethoden ergänzt werden sollte. Die Antikörpertestung in der Spätphase beziehungsweise nach abgelaufener Infektion eignet sich unter anderem für epidemiologische Fragestellungen (5, 6, 7, 8).

Schnelltests auf Antikörper liefern teils schon nach 15 Minuten ein Ergebnis. In der Frühphase der Infektion besitzen sie jedoch nur eine eingeschränkte Aussagekraft. Foto: picture alliance/Geisler/Fotopress
Schnelltests auf Antikörper liefern teils schon nach 15 Minuten ein Ergebnis. In der Frühphase der Infektion besitzen sie jedoch nur eine eingeschränkte Aussagekraft. Foto: picture alliance/Geisler/Fotopress

Neutralisationstests

Während bei den zuvor genannten Tests zur Detektion von Antikörpern gegen SARS-CoV-2 alle Antikörper erfasst werden, die gegen das Virus gerichtet sind, muss zum Nachweis neutralisierender (protektiver) Antikörper gegen SARS-CoV-2 ein Neutralisationstest (NT) durchgeführt werden. Hierbei handelt es sich um einen biologischen Test unter Verwendung von Zellkulturen. Dazu wird eine serielle Verdünnungsreihe des zu untersuchenden Patientenserums mit einer definierten Virusmenge von SARS-CoV-2 inkubiert.

Sofern spezifische neutralisationskompetente Antikörper im Patientenserum vorhanden sind, kommt es zur Ausbildung von Antigen-Antikörper-Komplexen. Anschließend wird das inkubierte Material auf eine suszeptible Zellkultur inokuliert und gemessen, inwieweit die Infektiosität des Virus durch die vorhandenen Patientenantikörper gehemmt (das Virus neutralisiert) wird. Angegeben wird die höchste Verdünnungsstufe, bei der die Zellkultur noch keine virusbedingten zythopathogenen Effekte aufweist.

Der Neutralisationstest weist eine hohe Spezifität auf, ist jedoch sehr arbeitsaufwendig, nicht beziehungsweise nur sehr bedingt automatisierbar und setzt die gezielte Tätigkeit mit replikationsfähigem SARS-CoV-2 voraus.

Dies ist nach § 5 BioStoffV nur in Laboratorien der Schutzstufe 3 möglich (9). Dadurch ist der Neutralisationstest nur bedingt geeignet für das breite Screening der Bevölkerung, hat aber einen wichtigen Stellenwert zum Beispiel bei der Auswahl von Spendern für Rekonvaleszentenplasma.

Neben der spezifischen, humoral vermittelten Immunität lässt sich die zellvermittelte Immunität durch SARS-CoV-2-antigenspezifische T-Zellen nachweisen. Diese Methodik ist Speziallaboren vorbehalten. In einem arbeits- und laboraufwendigen Verfahren mittels Durchflusszytometrie und FACS-(fluorescence-activated cell sorting-)Analyse werden T-Zell-Populationen erfasst, die nach Stimulation mit einem spezifischem SARS-CoV-2-Antigen bestimmte Zytokine (z. B. IFNγ, TNFα oder auch IL-2) produzieren (10). Auf diese Weise ist es möglich, die T-Zell-Immunantwort festzustellen. Diese Tests finden derzeit ausschließlich in wissenschaftlichen Analysen Anwendung.

Antigene als Indiz

Über die diagnostische Aussagekraft von Streifentests (meist Lateral-Flow-Tests), welche SARS-CoV-2-spezifisches Antigen aus Untersuchungsmaterial der oberen Atemwege nachweisen, gibt es bislang nur begrenzt Evidenz. In den Tests werden häufig monoklonale Antikörper verwendet, die gegen das Nukleokapsid-(N-)Protein und/oder die S1-Domäne des Spike-Proteins gerichtet sind. Die Tests liefern meist innerhalb von 15 Minuten nach Probenmaterial- und Pufferzugabe ein qualitatives Ergebnis.

Die Sensitivität ist der PCR-Methode deutlich unterlegen – meist um mehrere Log10-Stufen. Während der positive prädiktive Wert (PPW) dieser Tests im Allgemeinen sehr hoch ist (> 95 %), ist der negative prädiktive Wert (NPW) abhängig von der Viruskonzentration im Untersuchungsmaterial des Patienten, oft liegt er unter 50 %. Antigentests können deshalb nur orientierend, mit anschließender molekularbiologischer Testung, angewandt werden. Ein negatives Ergebnis im Antigentest schließt eine SARS-CoV-2 Infektion nicht aus.

Dr. med. Niko Kohmer
Prof. Dr. rer. med. Holger F. Rabenau
Institut für Medizinische Virologie
Universitätsklinikum Frankfurt am Main

Prof. Dr. med. Sandra Ciesek
Institut für Medizinische Virologie
Universitätsklinikum Frankfurt

Deutsches Zentrum für Infektionsforschung, Externer Partner Frankfurt am Main

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Dieser Artikel unterliegt nicht dem Peer-Review-Verfahren

Literatur im Internet:
www.aerzteblatt.de/lit1720
oder über QR-Code.

Besonderheiten bei der Präanalytik

Die Inkubationszeit von COVID-19 beträgt 1–14 Tage (Median 5–6 Tage), das Virus kann aber bereits 1–2 Tage vor Symptombeginn und von asymptomatischen Infizierten ausgeschieden werden (11). Zum Nachweis von SARS-CoV-2 ist der direkte Erregernachweis mittels PCR das Mittel der Wahl. In der Frühphase der Infektion eignet sich hierzu ein Abstrich aus den oberen Atemwegen (z. B. kombinierter Nasopharyngeal- oder Rachenabstrich), in der späteren Infektionsphase (i.d.R. ab der zweiten Woche nach Symptombeginn) ist Untersuchungsmaterial aus den unteren Atemwegen (Sputum, Trachealsekret, bronchoalveoläre Lavage) zu bevorzugen. Falls möglich sollte Material der oberen und unteren Atemwege untersucht werden (5, 6).

Abstrich- und Transportsysteme mit universellem Transportmedium sind besonders geeignet. Sollten diese nicht verfügbar sein, ist auch die Untersuchung aus einem Trockenabstrich möglich. Sollte kein tagesaktueller Transport möglich sein, kann das Untersuchungsmaterial kurzfristig bei 2–8°C gelagert werden (12). Die Aufbereitung der Untersuchungsproben im Labor hat unter Beachtung des Mitarbeiterschutzes und der entsprechenden Vorgaben des Ausschusses für Biologische Arbeitsstoffe zu erfolgen (9).

Demnach können nicht gezielte Tätigkeiten im Rahmen der Labordiagnostik von SARS-CoV-2 unter Bedingungen der Schutzstufe 2 durchgeführt werden. Alle Tätigkeiten, die zur Freisetzung von SARS-CoV-2 führen können, etwa das Öffnen von Probengefäßen, sind in der Sicherheitswerkbank der Klasse 2 durchzuführen. Dabei sind Schutzkittel und Handschuhe zu tragen. Atemschutzmaßnahmen (mindestens FFP2- Schutzmasken) und das Tragen von Schutzbrillen wird im Rahmen der Primärdiagnostik empfohlen.

1.
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2.
Zhao J, Yuan Q, Wang H, et al.: Antibody responses to SARS-CoV-2 in patients of novel coronavirus disease 2019. Clin Infect Dis 2020 Mar 28; doi: 10.1093/cid/ciaa344 CrossRef MEDLINE
3.
Liu W, Liu L, Kou G, et al.: Evaluation of Nucleocapsid and Spike Protein-based ELISAs for detecting antibodies against SARS-CoV-2. J Clin Microbiol 2020 Mar 30; doi: 10.1128/JCM.00461–20 CrossRef MEDLINE
4.
Okba NMA, Müller MA, Li W, et al.: Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2-Specific Antibody Responses in Coronavirus Disease 2019 Patients. Emerg Infect Dis 2020 Apr 8;26(7); doi: 10.3201/eid2607.200841 CrossRef
5.
To KKW, Tsang OTY, Leung WS, et al.: Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study. The Lancet Infectious Diseases 2020 Mar 23; doi: 10.1016/S1473–3099(20)30196–1 20)30196-1">CrossRef
6.
Wölfel R, Corman VM, Guggemos W, et al.: Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature 2020 Apr 1; doi: 10.1038/s41586–020–2196-x CrossRef MEDLINE
7.
Guo L, Ren L, Yang S, et al.: Profiling Early Humoral Response to Diagnose Novel Coronavirus Disease (COVID-19). Clin Infect Dis 2020 Mar 21; doi: 10.1093/cid/ciaa31 CrossRef MEDLINE
8.
Li Z, Yi Y, Luo X, et al.: Development and Clinical Application of A Rapid IgM-IgG Combined Antibody Test for SARS-CoV-2 Infection Diagnosis.J Med Virol 2020 Feb 27; doi: 10.1002/jmv.25727 CrossRef MEDLINE
9.
Ausschuss für Biologische Arbeitsstoffe (ABAS): Begründung zur vorläufigen Einstufung des Virus SARS-CoV-2 in Risikogruppe 3 und Empfehlungen zu nicht gezielten Tätigkeiten (Labordiagnostik) und gezielten Tätigkeiten mit SARS-CoV-2 2020; https://www.baua.de/DE/Aufgaben/Geschaeftsfuehrung-von-Ausschuessen/ABAS/pdf/SARS-CoV-2.pdf?__blob=publicationFile&v=3.
10.
Rokni M, Ghasemi V, Tavakoli Z: Immune responses and pathogenesis of SARS-CoV-2 during an outbreak in Iran: Comparison with SARS and MERS. Rev Med Virol. 2020 Apr 8; doi: 10.1002/rmv.2107 CrossRef MEDLINE
11.
World Health Organization: Report of the WHO-China Joint Mission on Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) 2020; https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/who-china-joint-mission-on-covid-19-final-report.pdf.
12.
World Health Organization: Guidance for laboratories shipping specimens to WHO reference laboratories that provide confirmatory testing for COVID-19 virus: interim guidance, 2 March 2020; https://apps.who.int/iris/handle/10665/331337.
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