ArchivDeutsches Ärzteblatt33-34/2020Pooling bei Coronatests: Eine Lösung mit Tücken

MEDIZINREPORT

Pooling bei Coronatests: Eine Lösung mit Tücken

Schlenger, Ralf

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Wissenschaftler und Politiker fordern die Ausweitung der Tests auf SARS-CoV-2 auf immer mehr Bevölkerungsgruppen. Die Testung in Gruppen durch Pooling-Verfahren könnte bei der derzeit niedrigen Durchseuchung eine ressourcenschonende und praktikable Option darstellen. Die Politik zögert allerdings noch mit der Umsetzung dieses Vorgehens.

Beim Pooling werden mehrere Abstrichproben gemeinsam per PCR auf Virus-DNA untersucht. Nur falls die Gesamtprobe positiv ausfällt, werden die Einzelproben noch einmal separat getestet. Foto: picture alliance/dpa/dpa-Zentralbild/Robert Michael
Beim Pooling werden mehrere Abstrichproben gemeinsam per PCR auf Virus-DNA untersucht. Nur falls die Gesamtprobe positiv ausfällt, werden die Einzelproben noch einmal separat getestet. Foto: picture alliance/dpa/dpa-Zentralbild/Robert Michael

Es ist ein simpler Trick: Man poolt die Abstriche mehrerer Testpersonen und analysiert zum Beispiel statt 5 individueller Proben eine Sammelprobe. Fällt der Gruppentest negativ aus, spart man sich den Material- und Zeitaufwand für die Einzeltests. Ist er positiv, führt man zusätzliche Tests mit den zurückbehaltenen Proben durch. Die Idee ist auch nicht neu: PCR-Pool-Testung wurde beispielsweise mit dem Aufkommen von AIDS in den 1990er-Jahren als Nachweis für HI- und Hepatitis-Viren im Blutspendewesen eingeführt.

Doch der Teufel steckt im Detail. Kritische Fragen sind: Wie steht es um die analytische Genauigkeit der Pool-Testungen im Vergleich zur Einzeltestung? Wie verlässlich sind negative Ergebnisse, wenn Proben verdünnt werden? Bis zu welcher Vortestwahrscheinlichkeit lassen sich Gruppentests sinnvoll durchführen? Für welche Settings bietet es sich überhaupt an – für begrenzte Gruppen wie medizinisches Personal oder für das oft geforderte Massenscreening? Und wie verhält sich der organisatorische Mehraufwand zur erzielten Einsparung von Kosten- und Reagenzien? Verschiedene Arbeitsgruppen in Deutschland wie international haben sich auf die Suche nach Antworten begeben und praktikable Verfahren für Gruppentestungen auf SARS-CoV-2 beschrieben.

Frankfurt Adjusted COVID-19-Test (FACT)

Die größte Erfahrung mit Massen-screenings haben wahrscheinlich die Blutspendedienste. Ein PoolingVerfahren für Tests auf SARS-CoV-2 wurde von Mitarbeitern des Blutspendedienstes des Deutschen Roten Kreuzes in Frankfurt am Main und des Instituts für Medizinische Virologie des Universitätsklinikums der Goethe-Universität Frankfurt bereits Ende März vorgestellt (1).

Die Herstellung der Mini-Pools mit meist 5 Proben sowie ihrer Rückstellmuster erfolgt in einem Speziallabor. Dies soll gewährleisten, dass keine Kontamination an sich negativer Proben stattfindet. Die Einzelproben werden auf dem üblichen Weg gewonnen. Jeder Abstrichtupfer wird zunächst in sein Archivröhrchen gegeben und anschließend in ein gemeinsames Pool-Gefäß. Interessanterweise konnten die Untersucher nachweisen, dass bei mehrmaligem Auswaschen eines Abstrichstäbchens die Viruskonzentration im Eluat nicht signifikant abnimmt (2).

„Da sich bei dieser Methode auch das Volumen im Pool-Gefäß nicht vermehrt, wird keine Verdünnung und damit keine Abnahme der Sensitivität beobachtet“, erklärt die Frankfurter Virologin Prof. Dr. med. Sandra Ciesek. Ringversuche hätten auf die Gleichwertigkeit von Einzel- und Pool-Testung nach diesem Verfahren hingedeutet, auch bei Proben mit geringer Konzentration an Virusmaterial. Die Pooling-Methode wurde an 50 unselektierten Patientenproben geprüft, die in 10 Minipools à 5 Proben geclustert und parallel einzeln getestet wurden. 4 Minipool waren positiv. Nachtestungen ergaben 5 positive Einzelproben. Die Nachtestung dauere bei einem vollautomatischen Prozess nur etwa 4 Stunden, sagt Prof. Dr. med. Erhard Seifried, Ärztlicher Direktor des Instituts für Transfusionsmedizin und Immunhämatologie in Frankfurt.

Beim Blutspendedienst rechnet man vor, dass sich mit der zum Patent angemeldeten Pool-Methode „umgehend in ganz Deutschland die aktuelle Anzahl von ca. 40 000 Untersuchungen pro Tag auf 200 000 bis 400 000 Untersuchungen steigern [lässt], ohne damit die hohe Qualität der Diagnostik zu reduzieren“ (1).

Die Pooling-Methode sei nicht vorgesehen für die Testung schwerkranker symptomatischer Patienten mit Verdacht auf eine SARS-CoV-2 Infektion und einer hohen Wahrscheinlichkeit für ein positives Testergebnis, stellt Seifried klar. Ihre Domäne sei das breite Screening systemrelevanter Gruppen wie medizinischer Teams, des Personals in der (Alten-)Pflege, bei der Polizei oder der Feuerwehr. Aber auch bei Bewohnern von Pflege- und Altenheimen könnte die Reichweite vorhandener Testkits durch das Pool-ing vervielfacht werden.

Minipool-Methode
Grafik
Minipool-Methode

Pool-Tests bei Mitarbeitern in Berliner Notaufnahmen

Die hohe Zahl infizierter Ärzte und Pflegender war ein wesentlicher Grund für die kritische Lage in Norditalien zu Beginn der Pandemie. Vor diesem Hintergrund wurde an der Charité Berlin schon im April ein Screening-Programm für Mitarbeitende der Zentralen Notaufnahme (ZNA) entwickelt und validiert (3). „Mitarbeitende entnehmen auf freiwilliger Basis mindestens wöchentlich selbst einen tiefen Nasen- und Rachenabstrich und erstellen auch den Pool von 3 bis 5 Proben selbst“, erläutert Prof. Dr. med. Martin Möckel, Leiter der Notfall- und Akutmedizin. Man komme ohne weiteres Personal aus. „Für jeden Abstrich entsprechende Schutzkleidung anlegen zu müssen, würde ein niederschwelliges und häufiges Testen wie in unserem Bereich unmöglich machen“, so Möckel. Vermieden würde durch das „Eigen-Pooling“ auch eine eventuelle sekundäre Kontamination der Proben im Labor, die als Ursache zweier falsch positiver Ergebnisse in der ZNA vermutet wird.

Bei der Bildung des „Tupfer-Pools“ werden keine zu lagernden Rückstellmuster gebildet. Positive Pools werden nach einem fixen Protokoll aufgelöst, die betreffenden Personen erneut einzeln getestet. Nur die positiven Tests einzelner Mitarbeitender werden intern und behördlich wie vorgeschrieben gemeldet. Durch die Verwendung von Pseudonymen einer Pool-Gruppe sei die Datensicherheit der Mitarbeitenden gewährleistet. Durch den Ansatz der freiwilligen Testung sei die Akzeptanz und Zufriedenheit des Personals mit dieser Maßnahme hoch.

Seit dem 24. April wird nach diesem Schema in 3 getrennten Notaufnahme-Einheiten an 2 Standorten der Charité auf SARS-CoV-2 getestet. 150 Pools von rund 200 Mitarbeitenden fanden während eines Monats den Weg ins Labor. Zu rund 600 Pool-Tests kamen lediglich 13 Einzeltests infolge positiver Pools. Nur eine Mitarbeiterin war letztlich SARS-CoV-2-positiv, eine 38-jährige Ärztin, zum Zeitpunkt des Abstrichs asymptomatisch. Sie entwickelte nach 2 Tagen in häuslicher Quarantäne typische Symptome. Der Verlauf war unkompliziert, der Ort der Ansteckung konnte nicht identifiziert werden. Alle Pools bis 14 Tage nach diesem Ereignis blieben negativ, sodass man von keiner weiteren Ansteckung von Mitarbeitenden ausgehen musste.

„Ein freiwilliges Pool-Testen selbst durchgeführter Abstriche auf SARS-CoV-2 stellt in Bereichen mit hohem Risiko, wie den Notaufnahmen, eine wirksame und kosteneffektive Maßnahme zum Personalschutz und zur Verhinderung einer unbemerkten Ausbreitung von COVID-19 in medizinischen Teams dar“, schlussfolgert Möckel. Die Ergebnisse bestätigten auch, dass das Sicherheits- und Hygienekonzept im „Risikobereich Notaufnahme“ der Charité funktioniere, obgleich Personal wie auch Patienten – außer im Umgang mit infizierten Personen – lediglich einfache chirurgische Mund-Nasen-Masken tragen.

Als Grenzen des Konzepts sieht Möckel, dass Mitarbeitende in der Lage sein müssen, einen technisch korrekten Abstrich selbst durchzuführen. Die Erfahrung mit kurzfristig eingesetztem Personal wie Schülern und Rettungsdienstpraktikanten zeige aber, dass dies mit wenig Anleitung bei fast allen möglich sei. Möckel kann sich eine Ausweitung der Selbsttest-Methode auch bei nichtmedizinischen, exponierten, homogenen Gruppen vorstellen, beispielsweise Lehrern.

Forscher im Saarland poolen erfolgreich bis zu 30 Proben

Auch Virologinnen und Virologen der Universität des Saarlandes entwickelten ein Protokoll, um SARS-CoV-2-Abstriche bei asymptomatischem medizinischem Personal im Pool-Verfahren zu analysieren. Im März 2020 wandten sie es bei 1 191 Abstrichen an, wobei bis zu 30 Proben gepoolt wurden. Es wurden nur 267 PCR-Tests benötigt, um 23 SARS-CoV-2-positive Personen zu identifizieren. Die Rate positiver Tests lag bei 4,24 %. „Unser molekularbiologisches Verfahren mittels RT-PCR-Methode war so empfindlich, dass wir Proben von bis zu 30 Personen in einem Teströhrchen zusammenführen konnten, um mit einem einzigen Test ein positives Ergebnis zu erhalten, auch wenn nur eine einzelne Probe tatsächlich Viren enthielt“, erklärt Prof. Dr. med. Sigrun Smola, Direktorin des Instituts für Virologie am Universitätsklinikum des Saarlandes (4).

Das Protokoll der Arbeitsgruppe um Erstautor Dr. rer. nat. Stefan Lohse, das Ende April in Lancet Infectious Diseases publiziert wurde, beschreibt Pool-Größen zwischen 4 und 30 Proben und geht besonders auf die Frage der Sensitivität ein (5). Die Ct-Werte (Cycle Threshold, Schwellenwertzyklus, siehe Kasten) sowohl für Hüll- als auch für Spike-Gen-Assays lagen in allen positiven Pool- wie Individualproben unter 30, womit die Abstriche sicher als positiv eingeordnet werden konnten. Die Ct-Werte wichen in Pool- und Einzelproben nicht mehr als 5 Zyklen voneinander ab.

Smola räumt aber ein, dass bei großen Pool-Bildungen grenzwertig positive Einzelproben unentdeckt bleiben könnten. Solche „Borderline“-Abstriche fänden sich typischerweise bei genesenen Patienten 14–21 Tage nach der symptomatischen Infektion. Die Pool-Größe könne aber an verschiedene Infektionsszenarien und Gegebenheiten der Infrastruktur angepasst werden. Andersherum, bei sehr niedriger zu erwartender Infektionsprävalenz (Vortestwahrscheinlichkeit) schlagen die Saarländer gar die Bildung von Sub-Pools vor, was die Anzahl der Re-Testungen weiter reduziere. Beispielsweise könnten 30 Proben 30 Sub-Pools zu je 10 Proben zugeteilt werden. Schlägt der Test im großen Pool an, werden zunächst die 10er-Pools reanalysiert und nur in jenen mit positivem Ergebnis die entsprechenden Rückstellmuster an Einzelproben. Mit dem beschriebenen Pool-Testverfahren werden in Zusammen-arbeit mit dem saarländischen Ge­sund­heits­mi­nis­terium alle Senioren und Pflegekräfte in 131 Pflege- und Seniorenheimen des Saarlandes getestet. Dies betrifft rund 22 000 Menschen in dem kleinen Bundesland (3).

Maximale Anzahl notwendiger Testungen bei einem Minipool von 5 Proben in Abhängigkeit von der Prävalenz
Tabelle
Maximale Anzahl notwendiger Testungen bei einem Minipool von 5 Proben in Abhängigkeit von der Prävalenz

Freiburger Test hart an der Nachweisgrenze

Einen weiteren „proof of concept“ des Minipoolings veröffentlichten Virologen um Prof. Dr. med. Marcus Panning in Freiburg ebenfalls schon Ende März (6). Die Autoren verwendeten hier Nukleinsäurepräparationen aus den Abstrichen. Sie beschreiben den diagnostischen Workflow als leicht anwendbar, schnell, kosteneffizient und ressourcenschonend. Sie boten ihn testweise Uni-Laboren in Bonn, Frankfurt, Leipzig und Regensburg an, die das Verfahren adaptierten und überprüften. Im Labor-Netzwerk wurden 700 Proben aus verschiedenen Regionen Deutschlands auf 70 Minipools verteilt. Ein positiver Fall wurde entdeckt.

Ein besonderes Augenmerk legten die Forscher auch hier auf die Nachweisgrenzen. Dass die RNA-Eluate beim Pooling-Vorgang 1:10 verdünnt wurden, spiegelte sich in einer fast exakt 10-fach höheren unteren Nachweisgrenze wider. Ausgehend von bei chinesischen COVID-19-Patienten gemessenen SARS-CoV-2-RNA-Konzentrationen zwischen 1,5 x 104 und 1,5 x 107 Kopien/Milliliter sehen die Autoren indes auch bei Minipools dieser Größe eine ausreichende Empfindlichkeit der PCR-Tests. Bei mild erkrankten oder asymptomatischen Personen sei aber über die Viruslast zu wenig bekannt.

Zwischenfazit: Durch geeignete Pooling-Verfahren können nicht nur definierte homogene Gruppen wie medizinisches Personal, sondern auch große Kohorten, auch mit asymptomatischen Menschen getestet werden, wobei eine massive Einsparung insbesondere von Testkits möglich ist. Die publizierten Verfahren unterscheiden sich grundlegend in der Herstellung und Art des Probengemischs und der Zahl der Proben im Pool. Damit sind sie unterschiedlich aufwendig und sensitiv und eignen sich nicht unbedingt außerhalb des geprüften Settings. Zumindest bei kleinen Poolgrößen (ca. 5–10 Proben) ist die diagnostische Sensitivität zur Erkennung deutlich positiver Proben (Ct-Werte < 30) nicht reduziert. Selbstabstriche mit Bildung von Tupferpools reduzieren im Vergleich zur Pool-Bildung im Labor den organisatorischen und Prozessaufwand am stärksten, jedoch unter Verzicht auf Rückstellmuster.

Laborverband verficht die Individualtestung

Das Prinzip Pooling sieht man beim Interessenverband der Akkreditierten Labore in der Medizin (ALM e.V.) kritisch. Eine Pressemitteilung vom 30. Juni 2020 erklärt, dass in Deutschland die Testkapazität die Anzahl der angeforderten Tests deutlich übersteige, dass sie flächendeckend verfügbar sei, auch in ländlichen Gebieten, und dass sie kontinuierlich ausgeweitet werde.

Dem widersprechen Mediziner wie Ciesek deutlich: „Aktuell gibt es zwar genug PCR-Kapazitäten, aber bestimmte Diagnostikfirmen haben immer noch ein limitiertes Kontingent und die Reagenzien sind nicht in der gewünschten Menge verfügbar. Zum Beispiel hatten wir Probleme, genügend Testkits vom Hersteller Roche für unsere Kindergartenstudie zu bekommen. Vielerorts wird in Krankenhäusern und in Pflegeeinrichtungen bislang nicht flächendeckend zum Beispiel bei jeder Neuaufnahme, getestet.“ Würde man alle Risikogruppen flächendeckend, in ganz Deutschland zum Beispiel 2-mal pro Woche testen wollen, käme man ganz schnell an Grenzen.

Auch für Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. Ruprecht Keller, Facharzt für Laboratoriumsmedizin und vormals Leiter des Zentrallabors an den Kliniken der Stadt Köln, ist Pooling „aus pragmatischen Gründen unabwendbar“. Zunächst, weil viele Firmen, Arztpraxen und Einzelpersonen Labors mit einer PCR-Analyse beauftragten, ohne dass die Krankenkassen die Kosten der Untersuchung trügen. „Diese Einsender übernehmen ungern die Kosten der Einzeltests, wodurch es mitunter zu Preiskämpfen mit Dumping-Angeboten komme, so Keller. Auf der anderen Seite stehe die zunehmende Probenzahl, die sich wegen der Analysezeiten und der Begrenztheit von Reagenzien ohne Pooling wahrscheinlich kaum bewältigen lasse.

Ob das Pooling auch mit einem Kostenvorteil in der medizinischen Routineversorgung einhergeht, darüber gehen die Meinungen auseinander. Keine dahingehenden Vorteile sieht der ALM: Kostensenkungen beim Reagenzienverbrauch würden durch die deutlich erhöhten Organisations- und Prozesskosten mehr als verbraucht, heißt es (7, 8). Auch Keller schätzt die Kostenersparnis durch die Reduktion des Reagenzienverbrauchs als „nicht so dramatisch ein, wie es den Anschein hat, da viele Schritte wie etwa die Extraktion nicht wegfallen“.

Kosteneinsparungen durch Pooling sind möglich

Die Frankfurter Mediziner haben dagegen mit dem FACT-Protokoll auch hinsichtlich der Kosten gute Erfahrungen gemacht. „Den Mehraufwand für Fachpersonal eingerechnet, sparen wir mit der Minipool-Methode an der Uniklinik Frankfurt rund ein Drittel der Laborkosten ein“, sagt Ciesek.

Im Falle, dass gar keine zusätzliche Laborarbeit nötig ist, wie in der Notaufnahme der Charité praktiziert, liegen die prozentualen Einsparungen weit höher, rechnet Möckel vor. „Das Labor möchte natürlich so viel testen wie es geht, denn damit wird Geld verdient“, meint er.

Weiterhin geht man beim ALM von einem „unstrittigen Verlust an diagnostischer Sensitivität einer PCR-Untersuchung beim Poolen“ aus. Auch Keller sieht „das wichtigste Problem in der Gefahr mangelnder Sensitivität“. Zwar hielten einige Labors Poolgrößen von 25–50 Proben für machbar. „Dies mag unter optimalen Probenbedingungen sogar funktionieren“, so der Labormediziner. Bei der großen Heterogenität des Probenmaterials hält er das Risiko von falsch negativen Ergebnissen bei sehr großen Pools aber für zu hoch.

Das bestätigen die vorliegenden Untersuchungen so pauschal allerdings nicht – insbesondere wenn, wie bei dem Frankfurter FACT-Modell, gar keine Verdünnung stattfindet. „Rein technisch gibt es beim Pooling ausgereifte Lösungen, die in der Lage sind, bei ausreichender Sensitivität den Probendurchsatz gewaltig zu erhöhen“, sagt Panning. Vor diesem Hintergrund hält der Freiburger Virologe Einwände wie mögliche Haftungsfragen, Probenverwechslung oder Zeitverlust für fragwürdige Argumente. Ralf Schlenger

Literatur im Internet:
www.aerzteblatt.de/lit3320
oder über QR-Code.

Der Ct-Wert

Der Ct-Wert (Cycle Threshold, Schwellenwertzyklus) spielt vor allem für die Quantifizierung von Nukleinsäuremolekülen bei einer quantitativen Real-Time-PCR eine Rolle. Er stellt die Zahl der Amplifikationszyklen dar, die nötig sind, um Virusgene nachzuweisen. Als relatives Maß für die Konzentration der Zielgene in der PCR-Reaktion erhöht er sich mit abnehmender Konzentration des Virusmaterials.

1.
Pressemitteilung der Goethe Universität Frankfurt am Main, 30. März 2020; http://daebl.de/KS92 (last accessed 6. August 2020).
2.
Schmidt M, Hoehl S, Berger A, et al. FACT- Frankfurt adjusted COVID-19 testing – a novel method enables high-throughput SARS-CoV-2 screening without loss of sensitivity. Preprint-Publikation auf medRxiv am 1. Mai 2020; doi: 10.1101/2020.04.28.20074187 CrossRef
3.
Möckel M, Hofmann J, Edelmann A, et al.: Konzept und Validierung einer SARS-CoV-2-Pooltestung bei Mitarbeitenden der Notaufnahmen. Das Krankenhaus 08/2020.
4.
Meyer R, Pooling-Verfahren ermöglicht Corona-Massentests. Deutsches Ärzteblatt (online) 5. Mai 2020; https://www.aerzteblatt.de/nachrichten/112549/Pooling-Verfahren-ermoeglicht-Corona-Massentests (last accessed 6. August 2020).
5.
Lohse S, Pfuhl T, Berkó-Göttel B, et al.: Pool-ing of samples for testing for SARS-CoV-2 in asymptomatic people. The Lancet Infectious Diseases 2020 April 28, doi: 10.1016/S1473-3099(20)30362-5 CrossRef
6.
Eis-Hübinger, Hoenemann M, Wenzel JJ, et al.: Ad hoc laboratory-based surveillance of SARS-CoV-2 by real-time RT-PCR using minipools of RNA prepared from routine respiratory samples. Preprint-Publikation auf medRxiv am 31. März 2020; doi: 10.1101/2020.03.30.20043513 CrossRef MEDLINE PubMed Central
7.
Pressemitteilung der Akkreditierten Labore in der Medizin (ALM) vom 30. Juni 2020; http://daebl.de/QG15 (last accessed 6. August 2020).
8.
Positionspapier der Akkreditierten Labore in der Medizin (ALM) zum Pooling vom 15. Mai 2020; http://daebl.de/KR32 (last accessed 6. August 2020).
Minipool-Methode
Grafik
Minipool-Methode
Maximale Anzahl notwendiger Testungen bei einem Minipool von 5 Proben in Abhängigkeit von der Prävalenz
Tabelle
Maximale Anzahl notwendiger Testungen bei einem Minipool von 5 Proben in Abhängigkeit von der Prävalenz
1.Pressemitteilung der Goethe Universität Frankfurt am Main, 30. März 2020; http://daebl.de/KS92 (last accessed 6. August 2020).
2.Schmidt M, Hoehl S, Berger A, et al. FACT- Frankfurt adjusted COVID-19 testing – a novel method enables high-throughput SARS-CoV-2 screening without loss of sensitivity. Preprint-Publikation auf medRxiv am 1. Mai 2020; doi: 10.1101/2020.04.28.20074187 CrossRef
3.Möckel M, Hofmann J, Edelmann A, et al.: Konzept und Validierung einer SARS-CoV-2-Pooltestung bei Mitarbeitenden der Notaufnahmen. Das Krankenhaus 08/2020.
4. Meyer R, Pooling-Verfahren ermöglicht Corona-Massentests. Deutsches Ärzteblatt (online) 5. Mai 2020; https://www.aerzteblatt.de/nachrichten/112549/Pooling-Verfahren-ermoeglicht-Corona-Massentests (last accessed 6. August 2020).
5. Lohse S, Pfuhl T, Berkó-Göttel B, et al.: Pool-ing of samples for testing for SARS-CoV-2 in asymptomatic people. The Lancet Infectious Diseases 2020 April 28, doi: 10.1016/S1473-3099(20)30362-5 CrossRef
6.Eis-Hübinger, Hoenemann M, Wenzel JJ, et al.: Ad hoc laboratory-based surveillance of SARS-CoV-2 by real-time RT-PCR using minipools of RNA prepared from routine respiratory samples. Preprint-Publikation auf medRxiv am 31. März 2020; doi: 10.1101/2020.03.30.20043513 CrossRef MEDLINE PubMed Central
7.Pressemitteilung der Akkreditierten Labore in der Medizin (ALM) vom 30. Juni 2020; http://daebl.de/QG15 (last accessed 6. August 2020).
8.Positionspapier der Akkreditierten Labore in der Medizin (ALM) zum Pooling vom 15. Mai 2020; http://daebl.de/KR32 (last accessed 6. August 2020).

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