ArchivDeutsches Ärzteblatt18/2002Diagnostische Bedeutung frei zirkulierender Nukleinsäuren

MEDIZIN: Editorial

Diagnostische Bedeutung frei zirkulierender Nukleinsäuren

Reinhold, Uwe; Schröder, Claus H.

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LNSLNS Die Existenz von freien Nukleinsäuren im menschlichen Plasma wurde 1948 von Mandel und Métais (23) erstmalig beschrieben. Allerdings geriet diese Beobachtung über viele Jahre hin in Vergessenheit und wurde erst in den 60er-Jahren durch den Nachweis von zirkulierender DNA bei Patienten mit systemischem Lupus erythematodes (SLE) wieder aufgegriffen. In den folgenden Jahren wurde erkannt, dass freie nicht zell- oder virusgebundene Plasma-DNA nicht nur bei SLE-Patienten, sondern auch bei Patienten mit anderen Erkrankungen sowie bei gesunden Menschen vorkommt (14). In den 70er-Jahren wurde beobachtet, dass bei Patienten mit malignen Tumoren tendenziell eine höhere DNA-Konzentration vorliegt als bei Patienten mit benignen Erkrankungen. Heute geht man davon aus, dass ein signifikanter Anteil der zirkulierenden DNA im Serum/Plasma von Patienten mit malignen Erkrankungen aus Tumorzellen stammt (33).
Tumorerkrankungen
Die Diagnostik des frühen Metastasierungsstadiums ist ein wesentliches Problem in der Nachsorge von Tumorpatienten, da insbesondere bei Patienten in fortgeschrittenen Stadien der Erkrankung die Prognose durch eine drohende Fernmetastasierung drastisch verschlechtert ist. In der Vergangenheit sind daher zahlreiche Laboruntersuchungen für die Verlaufsdiagnostik von Tumorpatienten evaluiert worden. Viele der dabei eingesetzten Serumtests erwiesen sich jedoch als ungeeignet. Nach neueren Forschungsergebnissen kann aus Serum/Plasma von Tumorpatienten genetisches Material extrahiert werden, das Charakteristika der DNA aus Tumorzellen aufweist (33). Insbesondere können Mutationen von Onkogenen und Tumorsuppressorgenen (32), Gen-Rearrangements (7) und Genamplifikationen, Mikrosatellitenalterationen (24) sowie tumorassoziierte Hypermethylierungen regulatorischer Gensequenzen in DNA-Material aus zellfreiem Serum/Plasma analysiert werden. Beispielsweise gelang im Plasma von Patienten mit malignem Melanom im Stadium der regionären Metastasierung (Stadium III) der Nachweis tumorassoziierter Mikrosatelliten-DNA. Eine amerikanische Studie hat kürzlich gezeigt, dass die Präsenz solcher Mikrosatelliten-DNA im Plasma mit einer signifikant erhöhten Rezidivrate und einer verminderten Gesamtüberlebensrate einhergeht (27). Weiter gelang an Plasma-DNA von Patienten mit Prostatakarzinomen bei über 70 Prozent der Fälle der Nachweis einer tumorassoziierten Hypermethylierung spezifischer Gensequenzen. Vergleichbar hohe Anteile ergaben sich auch bei anderen soliden Tumoren. Bei einem Großteil der untersuchten Blutproben wurden kritische Mutationen in Bereichen klassischer Onkogene und Tumorsuppressorgene (K-ras, N-ras, p53) gefunden (1, 3, 25, 26).
Weitere potenzielle Anwendungsgebiete einer extrazellulären Nukle-
insäurendiagnostik ergäben sich für die Transplantationsmedizin über den Nachweis spenderspezifischer Nukleinsäuren in Serum/Plasma von Organtransplantierten im Verlauf von akuten und chronischen Abstoßungsreaktionen (22).
Virusassoziierte Tumorerkrankungen
Bei der Entstehung bestimmter Neoplasien spielen offensichtlich Viren eine zentrale Rolle. Zu diesen Erkrankungen zählt das in Südostasien gehäuft vorkommende Nasopharynxkarzinom, das ätiologisch mit einer Epstein-Barr-Virus-(EBV-)Infektion assoziiert ist. Kürzlich wurde von einer chinesischen Arbeitsgruppe gezeigt, dass bei einem Großteil der Patienten mit Nasopharynxkarzinom im Serum/Plasma freie EBV-DNA zirkuliert (20). Eine hohe Serumkonzentration dieser freien EBV-DNA war den Untersuchungen nach mit einem schwereren Krankheitsverlauf assoziiert und erwies sich damit als ein unabhängiger prognostischer Faktor. Kontrollierte Verlaufsstudien zeigten, dass klinische Vollremissionen mit einer Elimination der extrazellulären EBV-DNA einhergingen und dass ein erneuter Nachweis von zirkulierender EBV-DNA sehr frühzeitig ein beginnendes Rezidiv anzeigte.
Vergleichbare Resultate wurden auch bei Patientinnen mit Zervixkarzinomen erzielt. Bei der Entstehung dieser Tumorentität sind humane Papillomviren (HPV) beteiligt. So kann bei über 95 Prozent aller invasiven Zervixkarzinome integrierte HPV-DNA im Tumormaterial nachgewiesen werden. Bei einem hohen Prozentsatz der Zervixkarzinomzellen ist dies HPV-16-DNA. Nach neueren Forschungsergebnissen ist zirkulierende HPV-DNA bei bis zu 70 Prozent der Patientinnen mit Zervixkarzinomen nachweisbar (5). Die Präsenz von HPV-DNA im Plasma korrelierte jedoch nicht mit dem Tumorstadium. Allerdings war in erfolgreich behandelten Fällen mit nachfolgender Vollremission bei vorher HPV-DNA-positiven Fällen anschließend im Plasma keine HPV-DNA mehr nachweisbar, während Frührezidive und progrediente Erkrankungsstadien mit erneut oder persistierend positiven HPV-DNA-Befunden einhergingen.
Pränatale Diagnostik
Im Jahre 1997 gelang erstmalig der Nachweis fetaler DNA im Plasma von Schwangeren. Im Vergleich zur DNA aus zirkulierenden Fetalzellen ist die Menge von fetaler DNA im zellfreien Plasma/Serum deutlich höher (13, 18, 36). Während im ersten Trimenon der Anteil zirkulierender Fetalzellen etwa 0,001 Prozent der Blutzellfraktion beträgt, wird in dieser Schwangerschaftsphase bereits circa 3,4 Prozent der zirkulierenden Gesamt-DNA im Plasma durch fetale DNA repräsentiert. Im dritten Trimenon steigt dieser Anteil auf circa 6,2 Prozent an, während der Anteil fetaler Zellen im Blut der Schwangeren etwa 0,01 Prozent beträgt.
Es ist davon auszugehen, dass sich, basierend auf diesen Befunden, ein neues Anwendungsgebiet für die pränatale DNA-Diagnostik entwickeln wird (21, 28). Das einfache und nichtinvasive Verfahren, die DNA aus maternalem Plasma zu gewinnen, ist eine attraktive Alternative zu den
bisherigen invasiven Methoden der DNA-Gewinnung, beispielsweise zur Amniozentese. Die derzeit am weitesten entwickelte Anwendungsmöglichkeit betrifft die nichtinvasive Bestimmung des fetalen Rhesus-D-Status in maternalem Plasma (38). Weitere potenzielle Anwendungsmöglichkeiten für die pränatale Diagnostik betreffen die Früherkennung genetischer Erkrankungen, wie bei der myotonen Dystrophie (2) und der Achondroplasie (31) bereits gezeigt werden konnte. Nach neuen Untersuchungsergebnissen könnte die quantitative Bestimmung des fetalen DNA-Gehaltes im Plasma eventuell auch eine diagnostische Bedeutung bei schwangerschaftsassoziierten Erkrankungen, wie zum Beispiel der Präeklampsie (12,
16) und bei drohenden Frühgeburten erlangen (17). Im Serum von Schwangeren mit klinisch manifester Präeklampsie wurden im Vergleich
zu schwangeren Kontrollpersonen bis zu fünffach erhöhte Konzentratio-
nen an fetaler DNA beobachtet (19). Erste Verlaufsstudien haben ergeben, dass der Anstieg der fetalen DNA-Konzentration im Serum zeitlich der klinischen Manifestation der Präeklampsie vorausgeht und als diagnostischer Parameter bei Risikopatientinnen genutzt werden kann (16).
RNA zellulären und viralen Ursprungs
Einer makroskopisch nachweisbaren Fernmetastasierung geht eine zeitlich variable Phase voraus, in der bereits Tumorzellen im peripheren Blut vorhanden sind. Die frühzeitige Detektion von Tumorzellen im peripheren Blut könnte daher bei klinisch tumorfreien Patienten eine beginnende Fernmetastasierung anzeigen (11). Die derzeit untersuchten Verfahren zum Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen beruhen im Wesentlichen auf der Identifizierung tumor- oder gewebeassoziierter RNA aus Blutzellmaterial.
Beispielsweise gelingt über den Nachweis von spezifischer mRNA für Tyrosinase, einem Schlüsselenzym bei der Melaninsynthese, der Nachweis von Tumorzellen im peripheren Blut von Melanompatienten. Verfahren zum molekulargenetischen Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen konnten allerdings bisher nicht standardisiert werden und sind selbst bei positiven Reaktionen hinsichtlich ihrer diagnostischen Relevanz umstritten. Erschwerend kommt hinzu, dass zirkulierende Tumorzellen offensichtlich nur passager und nicht permanent nachweisbar vorhanden sind (30).
Zellfreie RNA konnte bereits 1972 (14) bei gesunden Individuen, später auch bei Krebspatienten (37) nachgewiesen werden. Neue Perspektiven zur Fernmetastasierung ergeben sich aus dem erstmals 1998 geführten Nachweis von tumorassoziierter extrazellulärer RNA im Serum/Plasma von Patienten mit malignem Melanom (9, 15). Diese Beobachtung erschien zunächst unglaubwürdig, da im Serum/Plasma in hoher Konzentration RNA-abbauende Enzyme (RNasen) vorhanden sind. Allerdings gibt es Hinweise dafür, dass zirkulierende RNA über assoziierte Moleküle (zum Beispiel als RNA-Proteolipidkomplexe) vor dem Angriff von Serum-RNasen geschützt sein könnten (37). Eigene Untersuchungen bei Melanompatienten deuten darauf hin, dass extrazelluläre RNA im Serum innerhalb von Apoptosekörperchen vorliegt und damit vor einem Angriff RNA-abbauender Enzyme geschützt ist (10). Nachfolgende Studien haben die Präsenz tumorassoziierter RNA im Serum/Plasma auch bei Patienten mit anderen Tumorentitäten (Bronchial-, Pankreas-, Mammakarzinom) bestätigt (4, 6, 8).
Kürzlich wurde die Präsenz fetaler mRNA im Serum/Plasma von Schwangeren nachgewiesen (29). Ihre Identifizierung erlaubt daher grundsätzlich auch eine Analyse der fetalen beziehungsweise einer aberranten Genexpression.
Die Präsenz zellfreier RNA im Blut ist auch für die Infektion mit DNA-Viren belegt. Beispiele sind EBV-RNA bei Patienten mit Nasopharynxkarzinom (20) und HPV-E6-mRNA bei Patientinnen mit Zervixkarzinom (35). Untersuchungen der Autoren von RNA des Hepatitis-B-Virus (HBV) in Gewebe und Blut ermöglichen die Bestimmung verschiedener Stadien der chronischen Infektion und insbesondere auch der okkulten Infektion (34). Ein hierfür entwickeltes RT-PCR-Verfahren unterscheidet Transkripte voller Länge von verkürzten Transkripten, denen ein für die HBV-Replikation essenzieller Bereich fehlt. Eine Studie mit Gewebeproben von HBV-Trägern mit hepatozellulärem Karzinom belegte einen zunehmenden Anteil verkürzter RNA-Transkripte mit steigendem Alter der Patienten und mit der Progression hin zu nichtreplikativen Infektionsstadien. Bei der Untersuchung zirkulierender viraler RNA aus Serum ergab sich ein ähnliches Bild der Infektionsprogression. Die unterscheidbaren Formen viraler Serum-RNA gestatteten somit, im Zusammenwirken mit der konventionellen Serologie, Infektionsstadien differenzierter als bisher anzusprechen. Ein diagnostisches Potenzial liegt insbesondere in der Anwendung eines noch zu etablierenden automatisierten Nachweisverfahrens auf okkulte Infektionen, die bisher vielfach nur über Leberbiopsien erfassbar sind.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass im menschlichen Serum/Plasma nachweisbare Mengen an freien Nukleinsäuren vorliegen, die potenziell für die nichtinvasive medizinische Diagnostik genutzt werden können. Über die Herkunft und biochemische Struktur der frei zirkulierenden Nukleinsäuren ist bisher nur sehr wenig bekannt. Die vorliegenden Studienergebnisse deuten jedoch an, dass über den spezifischen Nachweis freier DNA und RNA neue diagnostische Ansätze entwickelt werden können, deren zukünftige Anwendung in der Frühdiagnostik, Therapieeffizienzkontrolle und im Patientenmonitoring nach erfolgter Therapie liegen könnte. Weitere Forschungsanstrengungen zur Etablierung und Optimierung der Methodik und zur Standardisierung der Technik sind erforderlich, um den klinischen Wert dieses neuen diagnostischen Ansatzes sicher beurteilen zu können.
Manuskript eingereicht: 26. 3. 2001; revidierte Fassung angenommen: 16. 1. 2002

zZitierweise dieses Beitrags:
Dtsch Arztebl 2002; 99: A 1224–1228 [Heft 18]

Die Zahlen in Klammern beziehen sich auf das Literaturverzeichnis, das über den Sonderdruck beim Verfasser und über das Internet (www.aerzteblatt.de) erhältlich ist.

Anschrift der Verfasser:
Prof. Dr. med. Uwe Reinhold
Universitäts-Hautklinik und Poliklinik
Universitätskliniken des Saarlandes
66421 Homburg/Saar

Prof. Dr. rer. nat. Claus H. Schröder
Abteilung Virus-Wirtszell-Wechselwirkungen
Deutsches Krebsforschungszentrum
Im Neuenheimer Feld 280
69120 Heidelberg
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