ArchivDeutsches Ärzteblatt41/1996Aktueller Stand der Gentherapie: Konzepte, klinische Studien und Zukunftsperspektiven

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Aktueller Stand der Gentherapie: Konzepte, klinische Studien und Zukunftsperspektiven

Nikol, Sigrid; Höfling, Berthold

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LNSLNS Potentielle Vorteile der Gentherapie sind die Langzeitwirkung, die systemische oder lokale Regulierbarkeit der Genexpression, die relativ milde Einflußnahme auf physiologische Prozesse und die geringen Nebenwirkungen. Ergebnisse aus 185 klinischen Studien in den USA und Europa, sofern verfügbar, zeigten allenfalls partielle Erfolge, in Einzelfällen jedoch auch dauerhafte Korrekturen. Um die Effizienz der Gentherapie zu verbessern und gleichzeitig größte Therapie-Sicherheit zu erreichen, geht die Entwicklung zunehmend in die In-vivo-Anwendung, kombiniert mit unterschiedlichen, optimierten Vektoren mit induzierbaren und im Idealfall sogar Zelltyp-spezifischen Promotoren sowie neuerdings auch speziellen lokalen Applikationstechniken.


Der wesentliche Unterschied zwischen Gentherapie und konventioneller medikamentöser Therapie besteht darin, daß der eigentliche Wirkstoff nicht mehr direkt verabreicht wird, sondern der Körper dazu gebracht wird, sich die Wirkstoffe, die er braucht, selbst herzustellen. Vorteile sind im Idealfall die Langzeitwirkung, die systemische oder lokale Regulierbarkeit der Genexpression, die relativ milde Einflußnahme auf physiologische Prozesse und die geringen Nebenwirkungen. Spricht man heute im Zusammenhang mit der klinischen Anwendung von Gentherapie, so ist in der Regel die Behandlung von somatischen, das heißt differenzierten Zellen gemeint. Gentherapie meint nicht die Veränderung von Keimzellen, gleichbedeutend mit der Schaffung eines transgenen Organismus durch die Veränderung des Genoms aller Körperzellen, sondern lediglich die Korrektur, wo eine Erkrankung oder Fehlbildung vorliegt.


Wahl des therapeutischen Gens
Die Wahl des therapeutischen Gens hängt im wesentlichen von der Grundkrankheit ab: fehlende oder defekte Gene können bei singulärem Genmangel oder -defekt ersetzt werden; bei proliferativen Erkrankungen können körperfremde, therapeutische Gene (zum Beispiel Suizid-Gene, Resistenz-Gene) oder bereits vorhandene Gene zusätzlich eingeschleust werden, die in die Regulation natürlich vorkommender Gene eingreifen (wie Zellzyklus-regulierende Gene oder Immunmodulation mit Zytokinen). Es besteht die Wahl, auf DNA-Ebene durch DNA-Transfer oder Transkriptionshemmung mittels kompetitiv wirkender DNA-Fragmente wie Tripelhelix-formenden Oligonukleotiden einzugreifen, oder auf RNA-Ebene mit Hilfe von antisenseOligonukleotiden, katalytischen Oligonukleotiden oder Ribozymen die Translation der genetischen Information in das biologisch aktive Protein zu verhindern.


Auswahl von Vektor und Zelltyp
Soll eine besonders hohe Transfektionseffizienz erreicht werden, bevorzugt man die unselektiven Adeno- und Sendaiviren. Ist eher eine Limitierung auf proliferierende Zellen gewünscht, wie bei Tumorerkrankungen und anderen proliferativen Erkrankungen, werden die selektiven Retroviren und adenoassoziierte Viren verwendet. Je nach betroffener Zellart kann die Selektivität des Gentransfers durch bestimmte Übertragungshelfer (Vektoren) gesteigert werden (Tabelle 1). Man macht sich hier vor allem den Tropismus verschiedener Viren zunutze, wie zum Beispiel die Vorliebe der Herpesviren für Zellen des ZNS oder der Adenoviren für Lungenzellen. Neben den viralen Vektoren gibt es chemische und mechanische Möglichkeiten der Verbesserung der Transfer-Effizienz wie die Liposomen (Grafik 1) oder den bisher fast ausschließlich experimentell verwendeten "Beschuß" mit beschichteten Partikeln oder die Kombination verschiedener Methoden, wie zum Beispiel den Liposomen-Senaivirus-Komplex.


Möglichkeiten des Gentransfers
Neben der Effizienz des Gentransfers ist vor allem auch die Sicherheit der Therapie von Bedeutung. Hier bieten sich mit dem in vivo und dem ex vivo oder "out of the body approach" zwei verschiedene Verfahren an. Historisch gesehen war zu Beginn der klinischen Versuche das Ex-vivo-Verfahren vorherrschend. Autologe Zellen werden aus den jeweils betroffenen Organen oder aus dem Blut gewonnen, in Kultur mit dem gewünschten Gen transfiziert und anschließend reinjiziert. Der Gentransfer findet so unter kontrollierten Bedingungen statt. Voraussetzung für die Überprüfbarkeit des Gentransfers ist allerdings ein erheblicher technischer Aufwand; außerdem besteht ein Verletzungsrisiko bei der Zellgewinnung und das Risiko einer Infektion der Körperzellen, die ex corpore nicht vom Immunsystem geschützt sind. Deshalb entstanden zunehmend Bestrebungen, Gene oder Gen-Fragmente in vivo direkt zu applizieren (Grafik 2).
Bei der Markierung von Tumorgenen und der Applikation von Genen, die Resistenz gegen Chemotherapeutika vermitteln sollen (drug resistance genes), ist die systemische Anwendung erwünscht. Bei der Behandlung von bestimmten Gendefekten und proliferativen Erkrankungen wird dagegen die lokale Therapie bevorzugt. So werden Aerosole bei der Behandlung der Mukoviszidose verwendet, transfizierte Leberzellen beim LDLRezeptor-Mangel und die lokale Gentherapie bei der Restenose nach Angioplastie. Die Sicherheit des Transfers kann verbessert werden, indem besondere Antriebsaggregate (Promotoren) verwendet werden, die die Transkription der DNA in RNA steuern. Sie können durch körpereigene Substanzen oder von extern zugeführten Medikamenten angeschaltet (induziert) werden. Die Selektivität des Gentransfers kann durch Promotoren, die lediglich in bestimmten Zelltypen oder Geweben aktiv sind, verbessert werden (17). Wird nun das geeignetste Transferverfahren mit dem individuell günstigsten Vektor mit einem induzierbaren und im Idealfall sogar Zelltyp-spezifischen Promotor kombiniert und durch eine spezielle lokale Applikationstechnik verabreicht, läßt sich maximale Sicherheit schaffen, ohne auf größte Effizienz verzichten zu müssen.


Meilensteine der Gentherapie
Die viralen Vektoren erwiesen sich für den Gentransfer als die effektivsten Transfer-Helfer. Sie stellen ein natürliches Vektor-System dar, das bereits Millionen von Jahren Zeit hatte, sich zu entwickeln, und bezüglich Spezifität, Expressions-Effizienz und Verringerung der Pathogenität während der Infektion optimiert ist (33). Am besten untersucht sind die Retroviren, weshalb sie für alle frühen klinischen Versuche verwendet wurden. Voraussetzung für die Entwicklung der retroviralen Gentherapie war die Erkenntnis, daß Tumorviren Körperzellen onkogen transformieren können, indem sie ihr virales Genom stabil in die DNA der Wirtszellen integrieren. Der nächste Schritt war die Entwicklung effektiver Möglichkeiten, DNA in die Zellen von Säugetieren zu transferieren. Zu Hilfe kamen Fortschritte in der rekombinanten DNA-Technologie, die es erlauben, große Mengen von reinen Gensequenzen zu isolieren und herzustellen. Erst die Charakterisierung von genetischen Erkrankungen und das Verständnis der Regulation des Zellzyklus machten allerdings die Auswahl geeigneter Zielfunktionen ("targets") möglich. Die ersten der genetischen Erkrankungen, die charakterisiert werden konnten, waren die Hämoglobinopathien. Die Meilensteine der klinisch angewandten Gentherapie sind im Textkasten zusammengefaßt.


Erste Ergebnisse
Am besten dokumentiert sind die in den USA durchgeführten klinischen Gentherapie-Studien, die sicher in diesem Bereich eine Vorreiterrolle spielen. Die Genehmigung und Registrierung dieser Protokolle erfolgt durch das "Recombinant DNA Advisory Committee" (RAC) der "National Institutes of Health" (NIH) (30, 31). Neuerdings gibt es auch publizierte Zahlen der "European Working Group of Gene Therapy" (12). Wenig bekannt ist, in welchem Umfang auch in anderen Ländern Gentherapie betrieben wird, in denen Genehmigungsverfahren weniger restriktiv gehandhabt werden. Seit 1989 wurden in den USA 149 (Stand April 1996) und in Europa 36 (Stand Januar 1996) Gentransfer-Protokolle für die klinische Testung registriert (Tabelle 2), wobei die Anzahl in den ersten Jahren exponentiell zunahm (Grafik 3). Während sich zuerst der größte Teil der Programme mit der gentechnologischen Markierung von Zellen zum besseren Verständnis von Tumorausbreitung und zur frühzeitigen Diagnosestellung beschäftigte, überwiegen heute die therapeutischen Studien (Grafik 3). Schwerpunkte bilden die Behandlungsversuche von malignen, monogenen und infektiösen Erkrankungen, neuerdings auch Therapieansätze bei chronischen Erkrankungen aus dem kardiovaskulären und rheumatischen Formenkreis. Bis Juni 1995 wurden in den USA 603 Patienten in die klinischen Studien eingeschlossen, in Europa 72 bis Januar 1996 (Tabelle 2). Über die Hälfte der Behandlungen erfolgte erst seit Anfang 1995, und dementsprechend wenige Daten sind über bisherige Erfolge verfügbar.


Adenosin-Deaminase-Mangel
Am besten überschaubar ist die Behandlung des Adenosin-Deaminase-(ADA)-Mangels beim schweren kombinierten Immunmangel (severe combined immunodeficiency disease, SCID). Der Beginn der Behandlung der ersten von insgesamt elf Patienten erfolgte vor sechs Jahren. Die Neonaten und Kinder erhielten wöchentliche Injektionen von ex vivo gentechnologisch veränderten, autologen Lymphozyten und/oder Knochenmarkszellen. Die Expression des transduzierten Gens konnte in bis zu 50 Prozent der Lymphozyten und 10 Prozent der Knochenmarkszellen nachgewiesen werden. Während die Expression in Lymphozyten aufgrund der begrenzten Lebensdauer der Lymphozyten maximal ein Jahr anhält, war die Expression in den Knochenmarkszellen noch nach mindestens 18 Monaten (23) beziehungsweise drei Jahren stabil (2, 1). Als günstig erwies sich die kombinierte Transduktion von peripheren Blutlymphozyten und Knochenmarkszellen, da ein schneller therapeutischer Erfolg durch Veränderung der Blutlymphozyten, die langanhaltende therapeutische Wirkung jedoch nur durch Integration des ADA-Gens in die Knochenmarkszellen erreicht werden kann. Tatsächlich konnte in klinischen Studien gezeigt werden, daß während des ersten Therapiejahres fast alle ADA-exprimierenden Lymphozyten von transduzierten peripheren Blutlymphozyten abstammen, später jedoch durch Lymphozyten ersetzt werden, die aus dem transduzierten Knochenmark abstammen (2). Nicht bei allen Patienten sprach diese Therapie an. Berichte über toxische Nebenwirkungen liegen bislang nicht vor. Bei keinem der Patienten wurde Helfervirus nachgewiesen. Alle Kinder sind heute bei guter Gesundheit und werden sicherheitshalber weiter mit dem an Polyäthylenglykol konjugierten ADA-Enzym behandelt (19).


LDL-Rezeptor-Mangel
Bei einigen Patienten mit familiärer Hypercholesterinämie erfolgt seit fünf Jahren der Transfer des Gens für den "low density lipoprotein" (LDL)-Rezeptor. Autologe Hepatozyten werden durch partielle Hepatektomie gewonnen und für den Gentransfer kultiviert. Nach retroviraler Transduktion werden die Zellen durch die Pfortader in die Leber reinjiziert. Als Zeichen der partiellen Korrektur konnte in einem der Patienten eine Senkung des LDL-Cholesterinspiegels und der LDL/HDL-Ratio über 18 Monate bewirkt werden (35, 14).


Mukoviszidose
Bisher liegen bei mindestens 67 Patienten (US 53 und EU 14) Ergebnisse über den Transfer des "cystic fibrosis transmembrane conductance regulator"-(CFTR)-Gens zur Behandlung der Mukoviszidose vor (30, 12). Die Applikation erfolgt in der Regel lokal über Aerosole und der Gentransfer adenoviral (US 53 und EU 6 Patienten), da Adenoviren Lungenzellen (und Leberzellen) bei der Transfektion bevorzugen, oder liposomal (US 0 und EU 8 Patienten). Adenoviral läßt sich in einigen Fällen über kurze Zeit eine komplette Korrektur des Proteinmangels, meist jedoch nur eine Verbesserung des Chlorid-Transports auf etwa 25 Prozent der Norm erreichen. Niedrige Dosen erwiesen sich oft als ineffizient, und hohe Dosen können zu massiven lokalen oder systemischen Entzündungsreaktionen führen. Hierbei wurde über Fieber, Tachykardie, Hypotonie, Hypoxämie und Lungeninfiltrate aufgrund einer alveolären Entzündung auf der Seite der Vektor-Administration mit Verminderung der vitalen und der totalen Lungenkapazität berichtet (10, 25), die allerdings trotz hoher Dosen nicht von allen Gruppen beobachtet wurden (37). Andere Arbeitsgruppen berichten dagegen über den molekularen Nachweis des Gentransfers ohne funktionelle Korrektur im Sinne einer Veränderung des ChloridTransports, gerade bei denjenigen Patienten, die die höchsten Virus-Dosen erhielten. Diese Patienten hatten starke lokale Entzündungsreaktionen mit dem Nachweis von neutralisierenden Antikörpern gegen Adenoviren im Serum (3, 22). Die Wirkdauer ist mit maximal neun Tagen relativ kurz (10, 25, 18), so daß wiederholte Applikationen erforderlich sind, die zu einer Sensibilisierung gegen diese ohnehin humanpathogenen Viren führen. Sekundäre, aber auch primär vorliegende hohe Antikörperspiegel gegen Adenoviren verringern wiederum die Effektivität des adenoviralen Gentransfers. Antikörper gegen Adenoviren wurden bei 50 Prozent der zweijährigen Patienten und 95 Prozent der 16- bis 34jährigen nachgewiesen (20). Aus diesem Grund wandte man sich verstärkt auch dem liposomalen Transfer des CFTR-Gens zu. Liposomal konnte bei neun Patienten eine partielle Korrektur mit einem Maximum nach drei Tagen und einem Rückgang zum Ausgangsspiegel nach sieben Tagen beobachtet werden. Nebenwirkungen wurden nicht beobachtet (8). Interessanterweise wurden bei den meisten Patienten zwar Plasmid-DNA und "messenger" RNA nachgewiesen, ohne daß dieser Nachweis mit dem funktionellen Ergebnis korrelierte. Um eine länger anhaltende Expression des CFTR-Gens zu erreichen, wurden inzwischen Protokolle mit dem adenoassoziierten Virus (AAV) als Vektor zugelassen, Ergebnisse liegen noch nicht vor.


Tumorerkrankungen
Singuläre Genmangelerkrankungen sind relativ selten. Aufgrund der Häufigkeit von Tumorerkrankungen ruhen auf der Gentherapie besondere Hoffnungen. Es ist deshalb nicht überraschend, daß die meisten genehmigten Gentransfer-Protokolle maligne Erkrankungen betreffen, Berichte über Ergebnisse sind bisher allerdings kaum verfügbar. Bei vier von fünf Patienten mit fortgeschrittenem Melanom konnte nach intratumoraler Injektion eines Plasmid-Liposomen-Gemisches mit dem Gen für das Klasse-IHistokompatibilitäts-Antigen HLA B7 dessen Expression nachgewiesen werden (26). In einem Fall erfolgte die lokale Behandlung mittels eines speziellen Katheters in eine entfernt gelegene Metastase (27). Durch die Expression des HLA B7 soll eine erhöhte Immunogenität der Tumorzellen und damit die Möglichkeit ihrer physiologischen Elimination bewirkt werden. Berichtet wird über einen deutlichen Rückgang des Tumorwachstums, in einigen Fällen sogar über die komplette Elimination des Tumors. Nebenwirkungen wurden in den wenigen Fällen nicht beobachtet. Vorläufige Daten berichten über spezifische und unspezifische Immunantworten auf Tumorzellen nach Ex-vivo-Gentransfer. Nach dem Transfer des Interleukin-4-Gens wurde über die Infiltration durch CD3+ und tumorspezifische CD4+T-Zellen berichtet (24). Nach Behandlung mit dem Interleukin-2-Gen kam es zu einer konsekutiven Vermehrung von CD16+ natürlichen Killerzellen und tumor-spezifischen CD8+ zytotoxischen T-Zellen (4).
Insgesamt wurde inzwischen bei mindestens 30 Patienten mit malignen Hirntumoren die Gentherapie eingesetzt. Ergebnisse liegen jetzt von 15 Patienten vor, denen HSV-tk-Gen tragende Retrovirus-produzierende Zellen in die Tumore injiziert wurden. Nach 14 Tagen erfolgte die systemische Behandlung mit Ganciclovir. In zwölf Läsionen von acht Patienten wurde eine über 25prozentige Reduktion des Tumorvolumens in der posttherapeutischen Frühphase beobachtet. Bei sechs Läsionen von vier Patienten konnte ein therapeutischer Effekt über vier bis 18 Monate nachgewiesen werden, obwohl das HSV-tk-Gen nur in sehr wenigen Zellen nachgewiesen werden konnte (<0,17 Prozent) (29).


HIV-Infektion
Bei der HIV-Infektion ist die Gentherapie bisher nicht aus dem Stadium des zunehmenden Verständnisses zur Biologie der Erkrankung und somit der therapeutischen Möglichkeiten hinausgekommen. Es konnte gezeigt werden, daß bestimmte mit Markergenen gekennzeichnete CD4+- und CD8+-T-Zellen nach Reinfusion bis zu zehn Monate überlebten (34). Sie könnten somit die Ausgangsbasis für genetisch modifizierte T-Zellen zur Therapie oder Prävention von HIV-Infektionen sein.


Gefäßkrankheit
Die periphere arterielle Verschlußkrankheit ist die erste kardiovaskuläre Erkrankung, bei der die Gentherapie eingesetzt wurde. Im Stadium IV der Erkrankung wurde das Gen des "vascular endothelial growth factor" (VEGF) bisher transluminal in 13 Patienten transferiert. Durch Angioneogenese und konsekutive Kollateralisierung konnte klinisch eine Verbesserung der Gehstrecke erzielt werden, parallel dazu eine Zunahme der Perfusion in der konventionellen und der Kernspin-Angiographie. Möglicherweise als zusätzlicher Beweis für die therapeutische Wirkung des Gens konnte die Ausbildung von großen "Spider naevi" im Bereich des Fußes beobachtet werden. Eine weitere Indikation zum Einsatz des VEGF bei der peripheren Verschlußkrankheit war die Prävention der Restenose nach Ballonangioplastie durch die frühzeitige Ausbildung eines Neo-Endothels. Hier erfolgte der Einsatz bisher bei vier Patienten, wobei bei dem bisher nur kurzen Beobachtungszeitraum von fünf Monaten bei keinem dieser Patienten eine Restenose beobachtet wurde (Isner, Persönliche Mitteilungen).


Verbesserungsmöglichkeiten und Zukunftsperspektive
Die Erwartungen an die Gentherapie als eine schnelle Lösungsmöglichkeit für sonst kaum behandelbare Krankheiten sind hoch. Die vorliegenden Ergebnisse – und viele stehen noch aus – bestätigen, daß zwar Hoffnung für die erfolgreiche Therapie oder zumindest auf Linderung besteht, weisen aber auch auf eine ganze Reihe von Problemen, die vor einer breiten klinischen Anwendung gelöst werden müssen. Dieser Zustand wird noch mehrere Jahre andauern. Es kann kein einheitliches Transferschema für alle betroffenen Krankheiten geben, die Art des Transfers muß an die Besonderheiten der jeweiligen Krankheit angepaßt werden. Vielversprechend sind die vielfältigen Entwicklungsmöglichkeiten, gleichermaßen im Hinblick auf Effizienz und auf Sicherheit.


Verbesserung der Vektoren


Retroviren
Ein Schwerpunkt ist die Verbesserung der viralen Vektoren (15). Am weitesten verbreitet sind Retro- und Adenoviren (Tabelle 3). Erstere wurden bisher in 75 Prozent der Patienten der USA und Europas eingesetzt. Eine stabile Expression für mindestens 36 Monate wurde nach retroviralem Gentransfer nachgewiesen, im Gegensatz zu maximal neun Tagen nach adenoviralem Transfer (9, 11) (Grafik 4). Weitere Vorteile der Retroviren sind neben der stabilen kolinearen Integration der DNA die ausgezeichneten Kenntnisse ihrer Biologie, niedrige Kopiezahlen, die relativ große DNA-Insertionsfähigkeit bis sieben Kilobasen (kb), die Selektivität für proliferierende Zellen und die nur seltene Humanpathogenität und Immunogenität. Ein Nachteil der Retroviren waren bisher die relativ niedrigen Virustiter von 106 bis 107 cfu pro Milliliter (cfu/ml). Durch die Herstellung von Virus-Pseudotypen, bei denen Proteine der Virushülle durch das "vesicular stomatitus virus"-(VSV)-G-Protein, das Hüllprotein eines Rhabdovirus, ersetzt wurden, können jetzt durch verbesserte Virusstabilität Virustiter über 109 cfu/ml erreicht werden (7). Ein weiteres Problem war die kurze Halbwertszeit der Retroviren in vivo, vor allem durch Degradation in Anwesenheit von Komplement. Eine mögliche Lösung, die bereits entwickelt wurde, ist der Einschluß von virus-produzierenden Zellen in Zellulosesulfat-Kapseln. Sie schützen vor der immunologischen Neutralisierung der Retroviren und ermöglichen die verzögerte Freisetzung über mindestens sechs Wochen. Eine andere Möglichkeit wäre wiederum die Herstellung von Pseudotypen mit einem veränderten Hüllprotein und damit modifizierter Antigenität oder die Entwicklung von Vektoren, basierend auf einer anderen retroviralen Klasse, wie zum Beispiel den Spumaviridae, die weniger sensibel gegenüber humanem Komplement sind (13). Die bisher für den klinischen Gentransfer verwendeten Retroviren enthalten alle Vektoren, die auf dem mouse leukemia virus (MLV) basieren. Ihre Selektivität für proliferierende Zellen ist bei malignen und anderen proliferierenden Erkrankungen ein großer Vorteil. Bisher ist es allerdings nicht möglich gewesen, stabil DNA in das Genom von nicht-proliferierenden Zellen zu integrieren, wie es zum Beispiel bei der Behandlung von monogenen Erkrankungen wünschenswert wäre. Angestrebt wird nun die Entwicklung von Vektoren auf der Basis des human immunodeficiency virus (HIV), die einen aktiven Transport von genetischem Material in den Nukleus erlauben und damit auch die Integration in nicht-proliferierende Zellen (21, 5, 6). Viel diskutiert ist auch die Möglichkeit der insertionellen Mutagenese durch die zufällige Integration des eingebrachten genetischen Materials in die Genome der Zielzellen. Hierdurch kann die Expression anderer zelleigener Gene vermindert oder sogar ganz ausgeschaltet werden, oder es können defekte Proteine produziert werden. Tatsächlich ist die Gefahr der Beeinflussung eines wachstumsregulierenden Proteins bei der therapeutischen Integration einzelner Gene statistisch sehr selten. Wie in vielen Tierexperimenten gezeigt werden konnte, ist die Onkogenese komplex und macht wiederholte Infektionen durch onkogene Viren erforderlich, eine einzelne Infektion reicht in der Regel nicht aus. Bisher liegt kein einziger Bericht über eine derartige Komplikation im Rahmen der zahlreichen klinischen Gentherapie-Studien im Laufe der letzten sechs Jahre vor. Obwohl diese Gefahr offensichtlich überschätzt wurde, werden Strategien zur lokusspezifischen Integration entwickelt. Eine Möglichkeit könnte in der Kombination der viralen Integrase mit einem Rekombinationsenzym bestehen, das nur an spezifische DNA-Konfigurationen bindet. Weitere Optimierungsbestrebungen sollen die Gewebespezifität erhöhen. Durch Veränderung der Antigenität der Hüllproteine sollen nur bestimmte Gewebe infiziert werden und durch zell- und gewebespezifische Promotoren die Expression der therapeutischen Gene nur selektiv erfolgen. Weiterhin kann die Expression der therapeutischen Gene mit bestimmten Promotoren mit Hilfe besonderer Medikamente systemisch, durch lokale Radiatio sogar lokal induziert werden.


Adenoviren
Neben den Retroviren haben bisher auch die Adenoviren eine große Rolle bei den klinischen Studien gespielt (US 53 und EU 10 Patienten) (Tabelle 3). Vorteile sind die relativ hohen Virustiter und Transfektionseffizienzen, unter anderem durch ihre Fähigkeit, auch ruhende Zellen zu transfizieren. Das Adenovirus liegt episomal im Kern vor, das heißt es wird nicht in das Wirtsgenom integriert (Grafik 5). Daraus resultiert der Nachteil, daß die transferierten Gene lediglich transient exprimiert werden. Bei bestimmten proliferativen Erkrankungen kann eine zeitlich limitierte Genexpression ausreichend sein, bei Gendefekten oder Genmangel-Erkrankungen ist eine lang anhaltende Expression wünschenswert. Hierdurch notwendige wiederholte Genapplikationen werden durch die Humanpathogenität der Adenoviren mit konsekutiven Entzündungsreaktionen und Antikörperproduktionen kompliziert. Obwohl sie normalerweise nur milde Infektionen des respiratorischen Traktes auslösen, können sie insbesondere bei Immunosuppression ernste, teils sogar tödliche Infektionen auslösen, wenn das Virus weitere Organe außerhalb seines Wirtsspektrums befällt (28). Der zytoplasmatische Transfer mit einer lediglichen transienten Genexpression ist ein unveränderliches Charakteristikum der Adenoviren. Um den wiederholten Transfer möglich zu machen und die Effektivität der adenoviralen Vektoren auch bei Vorliegen primärer Antikörpertiter sicherzustellen, wird derzeit die Antigenität der verwendeten Adenoviren verändert. Ein weiterer Nachteil der Adenoviren war bisher die relativ geringe Insertionsgröße. Es werden derzeit die Serotypen Ad5 und Ad2 verwendet. Nach Deletion der E1-Region ergibt sich Raum für 3,2 kb Fremd-DNA, nach zusätzlicher Deletion von E3 für mehr als zwei weitere kb. Da das Adenovirus mit insgesamt 105 Prozent seines Genoms bepackt werden kann, ergibt sich für die adenoviralen Vektoren der ersten Generation Platz von maximal 7,5 kb. Ein Nachteil der Entfernung von E3 ist eine potentielle Zunahme der Immunreaktion gegen das Adenovirus, da E3 dem Virus hilft, der Immunantwort des Gewebes zu entgehen. Eine Möglichkeit, der Immunantwort zu entgehen, könnte die frühe, fetale Gentherapie der Lunge sein, wie bereits im Rattenexperiment mit Hilfe eines Reportergens gezeigt werden konnte (32). Bei adenoviralen Vektoren der zweiten Generation fehlt die E4-Region und damit die Fähigkeit zur Eigenproduktion essentieller regulatorischer Genprodukte, die für die Replikation notwendig sind (Perricaudet, Persönliche Mitteilungen). In einem anderen Beispiel konnte neben E1A und E1B zusätzlich noch das adenovirale Element E2A aus dem Virusgenom entfernt werden. Die Folge waren substantiell längere Expressionszeiträume für das therapeutische Gen mit weitaus geringeren Entzündungsreaktionen (36). Vektoren der dritten Generation sind bisher kaum verfügbar. Hier konnten vor allem die Verpackungszellinien verbessert werden, indem sie mehr Virusproteine unter der Kontrolle stärkerer Promotoren produzieren und damit hohe Virustiter erreichen lassen (Perricaudet, Persönliche Mitteilungen) beziehungsweise weitere Elemente gleichzeitig aus den adenoviralen Vektoren entfernt werden. Die Gesamtkapazität kann so bis zu 10 kb erreichen, mit Virustitern höher als 1010pfu/ml (15). Die fehlende genetische Information des Adenovirus muß in eine andere Zelllinie integriert werden, die jetzt die adenoviralen Proteine in trans produziert. Werden diese Proteine überexprimiert, können sie für die jeweiligen Zellen toxisch sein, wodurch dieses Verfahren limitiert wird. Da Adenoviren basierend auf Serotyp Ad5 und Ad2 humanpathogen sind, besteht auch die Möglichkeit, daß deletierte Bestandteile der Adenoviren aufgrund früherer oder aktueller Infektionen als Fragmente in Zellen des menschlichen Organismus vorkommen und somit die Rekombination zu Wildtypviren möglich wird. Erst in diesem Jahr gelang es, wie in den Retroviren das gesamte Virusgenom durch therapeutische Gene zu ersetzen (16). Hierdurch bestehen mehr Platz für therapeutische Gene und gleichzeitig eine Verringerung des Risikos durch Wildtypviren.


Neue Vektoren
Neben der Verbesserung der meist verwendeten viralen Vektoren werden klinisch vereinzelt neue Viren eingesetzt. Dazu gehören Adeno-assoziierte Viren, die wie Retroviren eine stabile Integration erlauben, allerdings über weniger Raum für ein therapeutisches Gen verfügen, Vacciniaviren und Canarypoxviren. Berichte liegen derzeit noch nicht vor. Daneben spielen klinisch auch nicht-virale Helfer der Transfektion eine Rolle, allen voran die Liposomen (US 64 und EU 22 Patienten) (30, 12). Die Transfektionseffizienz war nur gering, durch die Weiterentwicklung von Liposomen könnte sie jetzt verbessert werden.


Lokale Applikation
Mit der Tendenz vom technisch aufwendigen Ex-vivo- zum einfacheren In-vivo-Gentransfer rückte auch die Entwicklung von lokalen Applikationsmethoden in den Vordergrund. Da die Direktinjektion von genetischem Material oder Virus-produzierenden Zellen in die Zielorgane nicht immer möglich ist, wurde eine Reihe vor allem perkutaner transluminaler Methoden mittels spezieller Katheter entwickelt. Sie erlauben die Verabreichung in fast alle innere Organe und Blutgefäße einschließlich der Koronarien (Abbildung).


Zukunftsperspektive
Ziel wird es sein, das richtige Gen im idealen Vektor und unter der Kontrolle eines spezifischen Promotors durch einen optimierten Applikationskatheter lokal zu verabreichen, um reproduzierbar ein Maximum an Effektivität und Sicherheit zu erreichen (Abbildung). Keines der geschilderten Probleme des Gentransfers erscheint unlösbar, sie brauchen allerdings Zeit. Auch wenn sich die Gentherapie derzeit noch in den Kinderschuhen befindet, basiert sie auf einer Reihe von soliden wissenschaftlichen Grundlagen; die bisher unzureichenden klinischen Erfolge reflektieren nur das Anfangsstadium einer neuen Therapieform. Die logischen Zusammenhänge, die dem Prinzip des Gentransfers unterliegen, sind verlockend. In Kombination mit dem Humangenomprojekt, das zur Aufdeckung der etwa 100 000 menschlichen Gene führen wird, die für den humanen Gentransfer verwendet werden könnten, ergibt sich ein enormes Potential für innovative Therapien und das zunehmende Verständnis für die menschliche Biologie. DNA als Medikament ist bereits Wirklichkeit, seine Möglichkeiten sind bisher jedoch nicht ausgeschöpft.


Zitierweise dieses Beitrags:
Dt Ärztebl 1996; 93: A-2620–2628
[Heft 41]
Die Zahlen in Klammern beziehen sich auf das Literaturverzeichnis im Sonderdruck, anzufordern über die Verfasser.


Anschrift für die Verfasser:
Dr. med. Sigrid Nikol
Medizinische Klinik I
Klinikum Großhadern
Marchioninistraße 15
81377 München

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