Diagnostische Molekularpathologie

Die klinische Pathologie hat in den vergangenen Jahren zahlreiche Methoden der Molekularbiologie an die wissenschaftlichen und diagnostischen Fragestellungen des Fachgebietes adaptiert. Nach der Einführung der Immunhistologie vor etwa 20 Jahren, die zur Immunphänotypisierung der Gewebsveränderungen führte und heute als Standard anzusehen ist, stellt die Molekularpathologie einen weiteren "Quantensprung" in der Entwicklung der pathologischen Diagnostik dar. Hieraus resultiert die Möglichkeit, tumoröse, infektiologische, hereditäre und andere Erkrankungen genotypisch zu charakterisieren und das damit erheblich erweiterte Befundspektrum in die funktionelle Diagnostik einzubringen. Möglichkeiten und Grenzen dieser Techniken in der täglichen Diagnostik werden dargestellt.

Die histo- und zytopathologische Untersuchung von Zell- und Gewebsproben stellt nach wie vor die unersetzliche Basis für die Mehrzahl medizinischer Diagnosen dar. Unter Anwendung konventioneller Verfahren ist allerdings in zahlreichen Fällen eine eindeutige Festlegung nicht möglich. Um eine höhere diagnostische Präzision zu erreichen, können die neuen Techniken der Molekularpathologie eingesetzt werden, die dem Kliniker präzisere Aussagen für sein therapeutisches Handeln liefern. Dabei ist die Molekularpathologie als Teilgebiet der Pathologie zu definieren, das unter Anwendung der Nukleinsäurenanalytik zur "genotypischen Diagnostik" von Erkrankungen beiträgt. Dies gilt für drei Bereiche:
! die Onkologie zur Bestimmung der Dignität, Prognose und mit Einschränkungen des therapeutischen Ansprechens,
! die Infektiologie zum Erregernachweis und
! die Gewebsidentifikation (speziell in der Rechtsmedizin, selten in der Pathologie).
Da die Untersuchungen größtenteils an formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem Material durchgeführt werden können, eröffnet sich ein breites Spektrum neuer Aufgaben. Im folgenden Beitrag wird eine Übersicht über Methoden und Anwendungsgebiete der molekularen Pathologie gegeben, um dem anfordernden Arzt – Kliniker und Niedergelassenen im gleichen Maß – Informationen über Möglichkeiten und Limitationen der aktuellen Entwicklung aufzuzeigen.

Das Methodenspektrum
Zur Basismethode hat sich die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit ihren zahlreichen Variationen entwickelt, wie beispielsweise kompetitive, geschachtelte, multiplex oder differentielle PCR. Die PCR erlaubt eine exponentielle Vervielfältigung von DNA und RNA und kann an Gewebshomogenaten, Zellsuspensionen und Einzelzellen oder an mittels Mikrodissektion gewonnenen Zellkernen durchgeführt werden. Das PCR-Produkt wird je nach Fragestellung mit verschiedenen Methoden analysiert, zum Beispiel Restriktionsendonukleaseverdau, denaturierende oder temperaturabhängige Gradienten-Gelelektrophorese, Southern Blot, Dot-Blot, direktes Sequenzieren, Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus oder Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus (3, 8, 14, 3, 30, 31). Als Erleichterung bei der praktischen Anwendung hat sich die Möglichkeit der nicht-radioaktiven Markierung der DNA-/RNA-Sonden, beispielsweise mit Digoxigenin oder Biotin, erwiesen (23).
Mit der Vielfarben-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) können ganze Genome und einzelne Genomabschnitte sichtbar gemacht werden (5). Dadurch gelingt es, molekulargenetische Analysen an Metaphasechromosomen und Interphasen-Zellkernen von konventionell aufgearbeitetem Zell- und Gewebsmaterial durchzuführen. Die Hybridisierung mit spezifischen Sonden erlaubt dabei die Detektion bekannter Läsionen. Die neue Methode der komparativen genomischen Hybridisierung (CGH) wird hingegen insbesondere als genetisches Screening auf unbekannte chromosomale Umlagerungen in soliden Tumoren eingesetzt. Das gegenwärtig noch begrenzte Auflösungsvermögen dieses Verfahrens wird zukünftig durch die Anwendung der konfokalen Lasermikroskopie weiter verbessert werden (15).
Von großer Wichtigkeit bei der Durchführung molekularer Verfahren sind die exakten Einzelfallkontrollen und Ringversuche zwischen verschiedenen Laboratorien. Außerdem muß darauf hingewiesen werden, daß Formalinfixierung und Paraffineinbettung zu Einschränkungen der Empfindlichkeit oben genannter Methoden führen können – ein Problem, das durch weiter verbesserte Techniken voraussichtlich an Bedeutung verlieren wird.

Notwendigkeit molekularpathologischer Untersuchungen
Um Mißverständnissen vorzubeugen, sei klargestellt, daß am Beginn aller zyto- und histologischen Untersuchungen die konventionelle Aufarbeitung steht und der Ausgangspunkt der diagnostischen Tätigkeit in der Pathologie, auch in der Molekularpathologie, die formalinfixierte, paraffineingebettete und in seltenen Fällen die tiefgefrorene Gewebsprobe ist. Erst nach deren Beurteilung sollte vom Pathologen entschieden werden, welche molekularen Zusatzuntersuchungen sinnvoll sind (21). Zur besseren Übersichtlichkeit werden die Indikationen an Hand der wichtigsten Anwendungsgebiete dargestellt.

Onkologie
Aufgrund der therapeutischen Konsequenzen muß die Diagnose eines Malignoms mit besonders hoher Verläßlichkeit gestellt werden. Auch die sich in der Onkologie immer mehr durchsetzenden individualisierten Therapiestrategien erfordern ein Höchstmaß an präzisen Aussagen über Histogenese, Prognose und, wenn möglich, über das Ansprechen auf die geplante Therapie. Ferner ist die Früherkennung kleiner Tumoren, erster Metastasen oder eines minimalen Resttumors ein akzeptiertes Ziel, das zur Verbesserung der Therapie und deren Wirksamkeit beitragen soll. Um diesen Anforderungen so gut wie irgend möglich gerecht zu werden, können die Detektion von Onkogenen, Tumorsuppressorgenen und die Bestimmung von tumorspezifischen Mutationen ein wertvoller Zusatz bei der Diagnose, Klassifikation, Prognoseabschätzung und Verlaufskontrolle von Malignomen sein (24).

Hämatologische Tumoren
Bei Verdacht auf ein malignes Non-Hodgkin-Lymphom (NHL) ist die Aufarbeitung der Lymphknotenbiopsie mit molekularen Methoden dann hilfreich, wenn reaktive Veränderungen, beispielsweise bei Virusinfektionen, nicht sicher von einem malignen NHL abgegrenzt werden können (Grafik 1). Der PCR-gestützte Nachweis monoklonaler Zellpopulationen sowie deren Linienzugehörigkeit (B- oder T-Zellen) ist hierbei diagnoserelevant (11, 25). Als molekulare Marker dienen klonspezifische Umlagerungen von Gensegmenten (V-, D-, J-) der Immunglobuline (Ig) bei B-Zellymphomen beziehungsweise der T-Zellrezeptor-Gene bei TZellymphomen. Die Umlagerung der Gensegmente ist die spezifische Visitenkarte des Zellklons, die auch bei einer neoplastischen Entartung erhalten bleibt.
Einige Beispiele: Die chronische myeloische Leukämie (CML) läßt sich über die PCR-gesteuerte Detektion der BCR/ABL-Translokation mit Überexpression des Fusionsproteins p210 (Tyrosinkinase) sicher beweisen. Bei Infiltration von extranodalem Gewebe (zum Beispiel Magenmukosa, Haut) mit suspekten lymphoiden Zellen und dem Verdacht auf ein MALT-Lymphom oder ein kutanes T-Zellymphom kann der Nachweis der Klonalität und Linienspezifität den Verdacht auf eine Neoplasie häufig schon in einem frühen Stadium untermauern (Tabelle 1). Allerdings bedeutet Monoklonalität nicht immer Malignität.

Epitheliale Tumoren
Spezifische, eine Tumorentität charakterisierende Mutationen sind in Karzinomen im Vergleich zu den hämatopoetischen Tumoren seltener. Epitheliale Tumoren sind hingegen insbesondere durch das Auftreten von Deletionen charakterisiert. Die damit assoziierte Inaktivierung eines oder mehrerer Tumorsuppressor-Gene ist vermutlich der entscheidende Mechanismus sowohl in der Ätiologie als auch der Tumorprogression (28). Da einzelne Mutationen jedoch in unterschiedlicher Häufigkeit auftreten, kommt deren Nachweis durchaus eine diagnostische Bedeutung zu.
So kann die Diagnose eines Pankreaskarzinoms an einem Feinnadelaspirat äußerst schwierig sein. Wird eine Mutation im K-ras-Gen (codon 12) gefunden, so liegt bei allen Patienten ein Karzinom vor (12). Auch in bronchoalveolären Lavagen ist die Detektion dieser Mutation fast beweisend für ein Bronchialkarzinom (17). Hier ist die hohe Sensitivität der Methode besonders nützlich, da der Nachweis aus nur wenigen Tumorzellen zwischen vielen normalen Zellen erfolgen muß. Die Detektion von Mutationen in Stuhl, Urinsediment und Sputum wird auch in der Früherkennung beziehungsweise Rezidivdiagnostik eingesetzt (33). Im Falle der Urindiagnostik wurde sogar gezeigt, daß die molekulargenetische Diagnostik der zytologischen überlegen ist (34, 18). Analoge Untersuchungen laufen für Kolon-, Ovarial- und Mammakarzinome.
Zur Erkennung von erblichen Krebserkrankungen ist der Nachweis der verantwortlichen Mutation in dem betreffenden Gen von zentraler Bedeutung (die ethische Problematik derartiger Untersuchungen soll hier nicht diskutiert werden). So wird bei Verdacht auf die familiäre Form des Brust- oder Eierstockkarzinoms das BRCA-1- oder BRCA-2-Gen auf bestimmte Keimbahnmutationen untersucht (Grafik 2). Dieser Nachweis gelingt heute mit den genannten Methoden aus Blutproben oder winzigen Gewebsproben von potentiellen Mutationsträgerinnen. Zur Sicherung der Familienanamnese kann noch nach Jahrzehnten an Paraffinmaterial, beispielsweise von früher entnommenen Tumoren von Familienangehörigen, der Mutationsnachweis erfolgen. Dies kann zur Differenzierung zwischen der familiären und sporadischen Form beitragen. Da eine große Anzahl verschiedener Mutationen in Betracht kommt und zunächst die Keimbahnmutation identifiziert werden muß, ist die genetische Untersuchung außerordentlich aufwendig. Somit wird diese Diagnostik voraussichtlich auch in Zukunft Hauptdomäne der Humangenetik bleiben. Eine vergleichbare Situation liegt bei Patienten mit hereditärem kolorektalem Karzinomsyndrom und Formen der multiplen endokrinen Neoplasie (MEN2) vor (Tabelle 1).
Bei Karzinomen konnte gezeigt werden, daß die Akkumulation genetischer Alterationen in vielen Fällen mit der Aggressivität der Tumoren korreliert (Grafik 3). So wurden in Kolonkarzinomen relativ häufig Veränderungen der Chromosomenabschnitte 5q, 17p und 18p detektiert, in Lungentumoren auf Chromosomenabschnitten 3p, 13q und 17p (26). Weniger das Vorhandensein einer einzelnen Läsion als vielmehr der multiplikative Effekt mehrerer Mutationen bestimmt die Prognose. Die Korrelation eines einzelnen genetischen Markers, zum Beispiel einer Mutation im p53-Tumorsuppressor-Gen, mit der Prognose hat zu widersprüchlichen Aussagen geführt. Sie kann möglicherweise im Einzelfall hilfreich sein (16). Der Nachweis mehrerer Aberrationen als Ausdruck einer genetischen Instabilität ist vermutlich besser geeignet, die Malignität eines Tumors abzuschätzen. Genetische Screening-Methoden wie die CGH (Grafik 4) könnten zukünftig eine große Bedeutung bei der Tumorgradierung bekommen. Eine genetische Tumorklassifizierung als Ergänzung der histologischen Bestimmung wäre für viele morphologisch nur schwer einschätzbaren Tumorentitäten wünschenswert.
Zukünftig werden bei Grenzfalltumoren die molekularen Zusatzuntersuchungen eine wichtige Rolle bei der Frage spielen, ob bereits eine metastasierungsfähige Läsion vorliegt. So konnte für Borderline-Tumoren des Ovars gezeigt werden, daß ein Heterozygotie-Verlust auf Chromosomenabschnitt 17p ein seltenes Ereignis ist, während es bei Ovarialkarzinomen in mehr als 60 Prozent auftritt (22). Bei Patientinnen kann der Nachweis einer X-Chromosom-Inaktivierung in einer Läsion einen Hinweis auf Klonalität geben, beispielsweise bei der Abgrenzung einer atypischen Endometrium-Hyperplasie von einem hochdifferenzierten Karzinom.

Mesenchymale und neurogene Tumoren
Liegt in dieser Tumorgruppe eine sogenannte klein- und rundzellige Läsion vor, so ist die "rein" morphologische Abgrenzung zwischen dem Ewing-Sarkom (ES), einem primitiven neuroektodermalen Tumor (PNET) oder einem anderen undifferenzierten Tumor in vielen Fällen schwierig (13, 19). Diese Frage spielt besonders in der Kinderonkologie eine Rolle. Der Nachweis einer Translokation (11;22) ist dann beweisend für ein ES (9). In der Differentialdiagnose zu einem alveolären Rhabdomyosarkom, das eine Translokation (2;13) aufweist, kann die Genanalyse eine klare Entscheidung herbeiführen (10). Auch für Liposarkome, Retinoblastome und weitere Sarkome sind charakteristische, nicht jedoch spezifische Genveränderungen beschrieben. Bei zahlreichen Weichteiltumoren sind aufgrund der therapeutischen Konsequenzen die genannten Zusatzuntersuchungen heute als diagnostischer Standard zu fordern (37).

Metastasensuche und minimale Resttumoren
Liegen bei einer hämotologischen Neoplasie definierte genetische Veränderungen vor, so können diese auch bei geringsten Tumorzellzahlen (105 bis 106) als minimale Residualerkrankung nachgewiesen werden. Dabei dienen zum Beispiel die Translokationen BCR/ABL bei CML, PML/RAR-a/MYL bei der Promyelozytenleukämie und IGHV/BCL2 bei follikulären Lymphomen als spezifische Marker (4, 20). Bei Malignomen ist die Bestimmung des Ausmaßes der Metastasierung oder die Suche nach wenigen Resttumorzellen nach einer Chemotherapie ein wichtiges Kriterium zur Entscheidung über Form und Intensität der nachfolgenden Maßnahmen. Dabei besteht bei der Frage nach Lymphknoten-, Organ oder Knochenmarksmetastasen stets die Schwierigkeit, daß bei konventioneller histologischer Aufarbeitung nur ein verhältnismäßig geringer Teil des Gewebes untersucht werden kann und somit eine maligne Infiltration möglicherweise unerkannt bleibt.
Dieses Problem kann überwunden werden, indem die Gesamt-RNA eines Lymphknotens präpariert und auf das Vorhandensein nicht-lymphozytärer mRNA, zum Beispiel für Zytokeratine oder tumorassoziierte Antigene, untersucht wird. Um bei diesem Vorgang eine hohe Sicherheit zu erreichen, ist es notwendig, mehrere Primerpaare gegen verschiedene nicht-lymphozytäre mRNAs, die revers transkribiert wurden, einzusetzen. Als Beispiele seien das östrogenrezeptor-positive Mammakarzinom und das für das prostataspezifische Antigen (PSA) positive Prostatakarzinom genannt, bei denen ein Primerpaar gegen die cDNA von Zytokeratinen und ein zweites gegen die des Östrogenrezeptorproteins beziehungsweise des PSA verwendet werden sollten. Mehrfach wurde gezeigt, daß beim Einsatz der PCR der Prozentsatz befallener Lymphknoten deutlich höher ist als bei (immun-)histologischer Aufarbeitung (6). Sollte sich dies bewahrheiten, so wird sich die Metastasensuche mittels PCR möglicherweise zu einem Routineverfahren entwickeln (40).
Besteht der Verdacht auf eine zerebrale Tumorläsion mit Anschluß an das Ventrikelsystem, so ist zum Beispiel der Nachweis des mutierten p53-Gens in Zellen aus dem Liquor ein starker Hinweis auf eine Tumorinfiltration (27).
Mit der CGH können gröbere genomische Veränderungen verschiedener Tumorproben eines Patienten charakterisiert und verglichen werden. Bei Übereinstimmung der Alterationen ist die Zuordnung PrimärtumorMetastase gegenüber zwei Primärtumoren eindeutig zu treffen – eine in der pathologischen Diagnostik häufige Frage.

Nachweis der Zytostatikaresistenz
Um bei disseminierten malignen Tumoren eine rationale Grundlage für Therapieentscheidungen zu erhalten, ist die möglichst genaue Bestimmung ihres Verhaltens gegenüber einer Chemotherapie durch die Bestimmung der Zytostatikaresistenz hilfreich (7). So kodiert beispielsweise das mdr-1-Gen für das membrangebundene Pumpprotein P-170, dessen Überexpression mit einer Resistenz gegen viele verschiedene Zytostatika assoziiert ist, der sogenannten multi drug resistance (MDR). Es wird in zahlreichen Tumoren primär oder sekundär nach Chemotherapie überexprimiert. Zum Nachweis der mdr-1mRNA in Gewebe wird die semiquantitative RT-PCR angewendet (1). Bei starker Expression des P-Glykoprotein haben sich die Tumoren in klinischen Studien als weitgehend resistent für MDR-Zytostatika erwiesen, so daß dann auf andere Substanzen zurückgegriffen werden sollte.

Infektionspathologie
Die Detektion von Viren, Bakterien, Parasiten und Mykoplasmen direkt am histologischen Gewebsmaterial stellt, insbesondere beim immunsupprimierten Patienten ohne zuverlässige serologische Befunde, zum Beispiel nach Chemotherapie oder Transplantation, bei hämatologischen Erkrankungen oder AIDS, den einzig möglichen Weg zum sicheren und spezifischen Nachweis dar. Hier liegt ein zukunftsweisendes Einsatzgebiet der Molekularpathologe (Tabelle 2), das an einigen Beispielen verdeutlicht wird.
l Der Nachweis einer Tuberkuloseinfektion, häufig mit histochemischen Färbungen nur unzuverlässig zu erreichen, ist mit molekularen Techniken präzise möglich (36, 39). Da das Gewebe nach Homogenisierung vollständig aufgearbeitet werden kann, wird zumindest theoretisch jedes Tuberkelbakterium einer Detektion zugeführt. Wegen zahlreicher technischer Probleme (Kontamination, Gewebeverschleppung et cetera) sei hier nochmals auf die Notwendigkeit entsprechender Kontrollen hingewiesen.
l Bei Patienten nach Transplantation ergibt sich eine Verschlechterung der Leberwerte. Es stellt sich die Frage, ob dies auf eine exazerbierte virale Hepatitis oder eine beispielsweise medikamenteninduzierte Leberinsuffizienz zurückzuführen ist. In diesem Fall kann an einer Leberstanzbiopsie der Virusnachweis oder -ausschluß mittels PCR und anschließender Hybridisierung schnell und zuverlässig erfolgen (2, 29), während die serologische Titerbestimmung nur eingeschränkt aussagekräftig ist. Zusätzlich können Mischinfektionen zum Beispiel mit Zytomegalieviren aufgedeckt werden.
l Ein AIDS-Patient zeigt die Symptome einer Hepatitis ohne entsprechende serologische Befunde. Die an der Biopsie durchgeführte PCR kann eine Infektion zweifelsfrei nachweisen und zusätzlich zwischen den verschiedenen Subtypen (beispielsweise HBV, HCV) differenzieren.
l Auch extrem seltene oder kürzlich entdeckte Erreger, wie der Hantaan-Virus (35) oder das humane HerpesVirus 8 (Abbildung), können bei Kenntnis der Erbinformationen mittels PCR diagnostiziert werden, ohne daß erst Antikörper für einen serologischen Test hergestellt werden müssen.
l In gynäkologischen Abstrichen können "maligne" HPV-Stämme (Typ 16, 18) mittels PCR erkannt und durch Restriktionsanalysen typisiert werden (38).

Gewebeidentifikation
Sollte in einem histologischen Labor einmal eine Probe nicht mit dem vom Einsender angegebenen Gewebe übereinstimmen, so ist die eindeutige "genetische Identifikation" möglich, wenn von dem Patienten eine weitere Probe oder auch nur einige Zellen (Plattenepithel- oder Schleimhautabstriche) zur Verfügung stehen. Diese werden dann molekular verglichen, indem mehrere polymorphe Marker in den betreffenden Proben untersucht werden. Eine relativ seltene, aber bei juristischen Auseinandersetzungen wichtige Möglichkeit.

Ausblick
Die voraussichtlich rasante Entwicklung der molekularen Methoden wird der Molekularpathologie zahlreiche zusätzliche Möglichkeiten zur Steigerung der diagnostischen Präzison eröffnen. Im Mittelpunkt stehen die Tumor- und Infektionspathologie. Vor dem Hintergrund begrenzter Mittel ist allerdings eindringlich auf die Notwendigkeit der kritischen und sorgfältigen Auswahl der einzusetzenden Zusatzuntersuchung hinzuweisen. Gewarnt wird auch vor einer euphorischen Überbewertung, da das technisch anspruchsvolle Methodenspektrum mit teilweise extrem hoher Sensibilität erhebliche Risiken insbesondere einer falsch positiven Aussage birgt. Daher sollten nur Arbeitsgruppen mit speziellen Fachkenntnissen in der diagnostischen Molekularpathologie tätig sein. Auf diesem Gebiet arbeitende Ärzte sollten die Zusatzbezeichnung "Molekularpathologie" vorweisen. Zusätzlich müssen sich die entsprechenden Laboratorien regelmäßigen Ringversuchen unterziehen, um ihre Kompetenz zu belegen.

Danksagung
Dr. Kölble und Dr. Petersen (Institut für Pathologie) wird für die intensive Mitarbeit am Manuskript gedankt, ebenso Dr. Scherneck (Max-Delbrück-Zentrum, Berlin-Buch) für die Überlassung der Abbildung.

Zitierweise dieses Beitrags:
Dt Ärztebl 1996; 93: A-2856–2863 [Heft 44]
Die Zahlen in Klammern beziehen sich auf das Literaturverzeichnis im Sonderdruck, anzufordern über den Verfasser.

Anschrift des Verfassers:
Prof. Dr. med. Manfred Dietel
Institut für Pathologie der Charité
Humboldt-Universität zu Berlin
Schumannstraße 20–21
10117 Berlin

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