ArchivDeutsches Ärzteblatt23/2003Zelltherapeutische Strategien für die Behandlung des Diabetes mellitus Typ 1: Von der Inselzelltransplantation zur Stammzelltherapie

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Zelltherapeutische Strategien für die Behandlung des Diabetes mellitus Typ 1: Von der Inselzelltransplantation zur Stammzelltherapie

Dtsch Arztebl 2003; 100(23): A-1604 / B-1328 / C-1245

Päth, Günter; Seufert, Jochen

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LNSLNS Zusammenfassung
Typ-1-Diabetiker sind nach der autoimmunen Zerstörung der Insulin produzierenden b-Zellen im endokrinen Pankreas lebenslang auf die Substitution mit Insulin angewiesen. Trotz moderner Therapieformen gelingt eine kontinuierliche Kontrolle des Blutzuckers nur bedingt. Schwere diabetische Komplikationen wie koronare Herzkrankheit, Schlaganfall, Retinopathie, Neuropathie, Amputationen und Nierenversagen sind häufig die Folge. Eine klinisch eingeführte Alternative ist die Transplantation von humanen Langerhans-Inseln, die aber durch die geringe Verfügbarkeit von humanem Spendermaterial limitiert ist. Bei der intensiven Suche nach neuen Quellen für b-Zellen sind Langerhans-Inseln von Schweinen und humane Stammzellen in den Fokus des wissenschaftlichen Interesses gerückt. Vor diesem Hintergrund erläutern die Autoren den aktuellen Stand der Forschung und präsentieren eine neue Strategie, die es ermöglichen soll, aus adulten Stammzellen des endokrinen Pankreas unbegrenzte Mengen von Insulin produzierenden Zellen für die b-Zell-Ersatztherapie zu generieren.

Schlüsselwörter: Diabetes mellitus, Inselzelltransplantation, Stammzelltherapie, Typ-1-Diabetes, Organtransplantation

Summary
Novel Cell Therapy for the Treatment of Diabetes Mellitus Type 1 – From Islet Transplantation to Stem Cell Therapy
Due to autoimmune destruction of the insulin producing pancreatic b-cells type 1 diabetic patients rely on lifelong substitution with insulin. Despite modern therapeutic strategies continuous control of blood sugar levels frequently fails. Severe diabetic complications, such as coronary heart disease, stroke, retinopathy, neuropathy, amputation and renal
failure frequently occur. A clinically established alternative therapy, the transplantation of human islets of Langerhans, is limited by the lack of donor organs. The intensive search for new sources of pancreatic b-cells now focuses on pancreatic islets from pigs and human stem cells. In the light of this new research the authors elucidate the current scientific status quo and present a new strategy to support pancreatic b-cell replacement therapy by generating unlimited amounts of insulin producing cells from adult stem cells of the endocrine pancreas.

Key words: diabetes mellitus, transplantation of islet cells, stem cell therapy, type 1 diabetes, transplantation of organs


Allein in Deutschland leben derzeit fast fünf Millionen Patienten mit Diabetes mellitus, und ihre Zahl steigt ständig. Viele dieser Patienten entwickeln Spätkomplikationen, wie beispielsweise koronare Herzkrankheit, Schlaganfall, Retinopathie, Neuropathie und Nierenversagen. Hierdurch entstehen enorme Belastungen für das gesetzliche Gesundheitssystem, wobei Patienten mit diabetischen Komplikationen deutlich höhere Kosten als Diabetiker ohne Folgeerkrankungen verursachen und damit wesentlich zur Kostenexplosion beitragen (26).
Da bisher, trotz moderner Insulinpräparate und intensivierter Insulintherapie, eine kontinuierliche Kontrolle des Blutglucosespiegels, und damit die Vermeidung von diabetischen Komplikationen, nur bedingt gelingt, wird weltweit intensiv nach Alternativen zur Substitution mit exogenem Insulin gesucht. Hierbei steht vor allem der zelltherapeutische Ersatz der zerstörten b-Zellen im Mittelpunkt. In der klinischen Vision würde im Idealfall die ambulante Transplantation von Langerhans-Inseln oder in vitro differenzierten Stammzellen, die je nach Lebensdauer des Transplantats in bestimmten Zeitabständen ersetzt werden müssen, bei Typ-1-Diabetikern die verlorene endogene glucosesensitive Insulinsekretion wiederherstellen und somit das Risiko von Spätkomplikationen bei geringem Aufwand und gesteigerter Lebensqualität drastisch senken. Der breite Einsatz zelltherapeutischer Strategien für die Behandlung des Diabetes mellitus Typ 1 erscheint aber nur realistisch, wenn hierdurch auch Kosten gegenüber der bisherigen Insulintherapie eingespart werden könnten. Schätzungen gehen derzeit jedoch davon aus, dass sich die b-Zell-Ersatztherapie dennoch zu einer kostengünstigen Alternative entwickeln kann (35).
Pankreas- und Inseltransplantation
Klinisch bereits eingeführt ist die Transplantation von ganzen Pankreata oder isolierten Langerhans-Inseln. Aufgrund der zur Vermeidung von Abstoßungen notwendigen Immunsuppression werden Pankreas oder Inseln meist gemeinsam mit Nieren transplantiert. Während die Transplantation eines Pankreas ein komplizierter Eingriff mit vielen potenziellen Komplikationen für den Patienten darstellt, können Injektionen von Pankreasinseln in die Leberportalvene (10) theoretisch auch ambulant durchgeführt werden. Gegen die Inseltransplantation sprach bisher die geringe Effizienz. So waren 65 bis 80 Prozent der Empfänger von intakten Pankreata, aber nur weniger als 20 Prozent der Empfänger von Inseln nach einem Jahr insulinunabhängig (7, 44). Als Hauptursachen für diese Diskrepanz gelten die b-Zell-schädigenden Auswirkungen der Aufreinigung von Inseln aus Spenderorganen und die diabetogenen Nebenwirkungen der herkömmlicherweise eingesetzten Immunsuppressiva. Hinsichtlich der Vision, Typ-1-Diabetiker durch die ambulante Injektion von Spenderinseln für ein bestimmtes Zeitintervall insulinunabhängig zu machen, ist die wesentlich geringere Zellmasse von Langerhans-Inseln sehr vorteilhaft. Werden Inseln allein transplantiert, entfällt der gesamte exokrine Anteil des Pankreas beziehungsweise die simutan transplantierte Niere. Als Folge wird eine bei weitem schwächere Immunantwort provoziert und die Immunsuppression kann deutlich moderater ausfallen.
Vor diesem Hintergrund wurde in einer als Edmonton-Protokoll bekannt gewordenen Studie ein neuer Ansatz getestet, bei dem Typ-1-Diabetiker mehrfach große Mengen AB0-kompatible Inseln ohne Beachtung des HLA-Typs erhielten (40, 41). Abweichend von den üblichen Protokollen wurden die Inseln in Kulturmedien ohne Fremdproteine aufbereitet, und die Patienten bekamen zur Minimierung diabetogener Effekte eine steroidfreie Immunsuppression mit nur geringen Mengen an Calcineurininhibitoren. Von den bisher 17 langfristig beobachteten Patienten der Studie waren nach einem Jahr 85 Prozent (statt bisher 14 bis 15 Prozent) und nach zwei Jahren 80 Prozent (vier von fünf) insulinunabhängig. Diese Strategie wird derzeit in einer weltweiten klinischen Studie in allen Inseltransplantationszentren weiter evaluiert. Trotz aller Erfolge ist die Anwendung der Pankreas- und Pankreasinseltransplantation durch den Mangel an geeigneten Spenderorganen limitiert.
Alternative Spenderquellen
Wegen der geringen Verfügbarkeit von humanem Spendermaterial für die b-Zell-Ersatztherapie wird intensiv nach alternativen Quellen für Insulin produzierende Zellen gesucht. Derzeit werden folgende Möglichkeiten erforscht: die Verwendung von Langerhans-Inseln, die aus Pankreata von Schweinen isoliert werden sowie die Vermehrung und Differenzierung von humanen Stammzellen unterschiedlicher Herkunft (Tabelle).
Xenotransplantation
Die große immunologische Barriere zwischen artfremden Organismen verstärkt die Abstoßungsreaktion gegenüber Xenotransplantaten. Um dies zu verhindern, werden zurzeit transgene Schweine entwickelt, die keine immunologisch relevanten Xenoantigene auf der Zelloberfläche exprimieren (8). Ein anderer Ansatz zur Verhinderung der immunologischen Abstoßungsreaktion von Xenotransplantaten besteht in der Mikroverkapselung des transplantierten Materials (Pankreasinseln, endokrine Vorläuferzellen des Pankreas). Hierfür wird derzeit das aus Algen gewonnene Polysaccharid Alginat getestet, das aus den polymer verknüpften Bausteinen b-D-Mannuronsäure und a-L-Guluronsäure besteht und durch Abschirmung vor der T-Zell-vermittelten Immunreaktion die Überlebenszeit des Transplantats auch bei Xenotransplantation verlängern kann (31). Völlig unklar bleibt aber das Risiko der Übertragung von artfremden Pathogenen, besonders des mit Leukämie assoziierten porcinen endogenen Retrovirus (PERV), auf den Menschen. PERV, dessen Erbinformation permanent im porcinen Genom integriert ist, kann Zellen anderer Organismen infizieren und bei Befall von Keimzellen vererbt werden (43). Obwohl eine Übertragung auf den Menschen bisher nicht nachgewiesen werden konnte (11, 33), wurde die Übertragbarkeit von PERV aus porcinen Zellen auf menschliche Zellen in vitro (34, 43, 46, 48) und auf xenotransplantierte diabetische Mäuse in vivo (9, 46) bereits gezeigt. Bei der Abwägung des potenziellen Risikos kommt Colin Michie (29) zu dem Fazit: „The histories of lentiviruses and prions have taught us about the untameabel distances between laboratory, the spread of infectious disease and public health. These same errors cannot be made again“.
In vitro differenzierte humane Stammzellen
Grundsätzlich unterscheiden sich pluripotente embryonale Stammzellen, die in beliebige Zelltypen differenzieren können, von adulten Stammzellen die nicht mehr pluripotent sind und eine geringere Selbsterneuerungsrate aufweisen. Die Annahme, dass adulte Stammzellen nur in Zellen des Herkunftsgewebes differenzieren können, ist heute widerlegt. Beispielsweise wurden bereits in vitro Zellen mit hepatischem Phänotyp aus adulten Stammzellen des endokrinen Pankreas (51) und neuroektodermale und entodermale Phänotypen aus mesenchymalen Knochenmarkstammzellen generiert (16). Welche Stammzellen eignen sich aber nach dem momentanen Stand der Wissenschaft für die b-Zell-Ersatztherapie?
Embryonale Stammzellen
Alle Zelltypen des adulten Säugetierorganismus entstammen letztlich einer einzigen Zelle, der befruchteten Oozyte, aus der sich durch Zellteilung zunächst das mehrzellige Präimplantationsstadium des Embryos, die Blastozyste, bildet. Diese frühe Differenzierung ist eng mit der Expression des Transkriptionsfaktors Oct4 in der inneren Zellmasse der Blastozyste assoziiert. Oct4 gilt als wichtiger Regulator der Pluripotenz früher embryonaler Zellen (2). Dementsprechend ist die innere Zellmasse der Blastozyste die wichtigste Quelle für pluripotente embryonale Stammzellen (45). In späteren Stadien der Embryonalentwicklung wird Oct4 nur noch in primordialen Keimbahnzellen exprimiert, die daher ebenfalls für die Gewinnung von Stammzellen mit pluripotentem Charakter genutzt werden können (39). Wegen ihrer Herkunft ist die Verwendung menschlicher embryonaler Stammzellen in Forschung und Therapie ethisch stark umstritten.
Ungeachtet ethischer Bedenken ist es verschiedenen internationalen Forschergruppen inzwischen gelungen, murine und humane embryonale Stammzellen in vitro in Insulin produzierende Zellen zu differenzieren (1, 27, 42). Die Transplantation solcher b-Zell-Phänotypen in die Milz von diabetischen Mäusen normalisierte deren Blutglucosespiegel innerhalb weniger Tage, und nur 6 von 15 der transplantierten Tiere (40 Prozent) wurden erneut hyperglykämisch (42). Transplantatabstoßungen wurden innerhalb des Untersuchungszeitraums von 16 Wochen nicht beobachtet, was auf eine geringe Immunogenität dieser Zellen hindeutet. Allerdings induzierten die transplantierten Zellen in ersten Experimenten maligne Teratome. Dies ist nicht weiter verwunderlich, da die Transplantation nativer embryonaler Stammzellen ein etabliertes Modell zur Induktion dieser Tumoren ist (20). Diese Eigenschaft kann, zumindest teilweise, durch die reduzierte mitotische Rekombination und die erhöhte Rate uniparentaler Disomie in diesen Zellen erklärt werden (6). Differenzierung und Selektion sind demnach kritische Faktoren. Eine Verwendung von embryonalen Stammzellen für die b-Zell-Ersatztherapie ist daher erst gefahrlos möglich, wenn der Entwicklungsprozess zur b-Zelle vollständig verstanden und eine exakte Nachahmung in vitro möglich ist.
Adulte hämatopoetische Stammzellen
Typ-1-Diabetes ist durch Transplantation von Knochenmark aus diabetischen Mäusen (13) und Menschen (18, 19, 47) auf nicht diabetische Individuen übertragbar. Dies weist darauf hin, dass Defekte in hämatopoetischen Stammzellen für die autoimmune Zerstörung von b-Zellen verantwortlich sind. Umgekehrt unterbindet der Transfer von normalem Knochenmark dauerhaft Insulitis und autoimmune Zerstörung von b-Zellen in bestrahlten diabetischen Mäusen (14, 15, 17, 23, 28, 38). Ob dieser Ansatz auch beim Menschen praktikabel ist, bleibt ungewiss. Es wurden aber bereits drei Fälle von Typ-1-Diabetikern mit malignen Erkrankungen beschrieben, die nach Knochenmarktransplantation keine Anzeichen von Autoimmunität mehr aufwiesen (30).
Weiterhin verhindert die immunologische Konditionierung des Empfängers durch sequenzielle Transplantation von spenderidentischem Knochenmark (zuerst) und Inselzellen (später) Transplantatabstoßungen dauerhaft (32), wobei eine zeitliche Differenz von 24 bis 48 h ausreicht (24). Sogar in diabetische Mäuse xenotransplantierte Inselzellen von Ratten überleben bei gleichzeitiger Knochenmarktransplantation langfristig (25, 49). Auch beim Menschen konnte die zusätzliche Gabe von spenderidentischem Knochenmark die Anzahl der Abstoßungen bei immunsupprimierten Patienten nach simultaner Transplantation von Niere und Pankreas im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne Knochenmarkspende von 71 Prozent (10 von 14) auf 45 Prozent (5 von 11) senken (4, 5). Obwohl nicht alle Patienten von der Knochenmarkspende profitierten, zeigen diese ersten Daten das große Potenzial dieses Therapieansatzes.
Adulte Stammzellen im Pankreas
Im Pankreas konnten adulte Stammzellen im Epithel der Pankreasgänge und in Langerhans-Inseln selbst nachgewiesen werden (Grafik 1). Duktale Stammzellen prädiabetischer NOD-Mäuse bilden in vitro unter dem Einfluss spezifischer Wachstumsfaktoren inselähnliche Strukturen, die funktionsfähige a-, b- und d-Zellen enthalten (36). Unter die Nierenkapsel implantiert, senkten diese Inselstrukturen die Blutglucosespiegel von diabetischen NOD-Mäusen auf annähernd normale Werte. Abstoßungsreaktionen wurden nicht beobachtet. Auch adulte Stammzellen des humanen Pankreas, sowohl duktale (3) als auch intrainsuläre (51), können in vitro funktionsfähige Inselstrukturen bilden, deren Effizienz aber in vivo beim Menschen bisher nicht getestet wurde.
Adulte Stammzellen des Pankreas sind durch die Expression des Filamentproteins Nestin charakterisiert (12, 51), das ursprünglich als Marker für neuronale Stammzellen im zentralen Nervensystem beschrieben wurde (22). Auch in isolierten Pankreasinseln des Menschen können Nestin-positive Stammzellen immunhistochemisch nachgewiesen werden (Abbildung a und b). Innerhalb der Langerhans-Insel umfasst diese Population adulter Stammzellen allerdings beim Menschen nur circa 5 bis 10 Prozent der Gesamtzahl an Zellen der Pankreasinsel. Dennoch können diese adulten Stammzellen aus dem endokrinen Pankreas des Menschen isoliert werden und in Zellkultur zu einer Reinkultur von Nestin-positiven Stammzellen herangezüchtet werden (Abbildung c und d). Darüber hinaus ist gezeigt worden, dass gerade diese Nestin-positiven intrainsulären adulten Stammzellen des endokrinen Pankreas das Potenzial besitzen, in vitro in Insulin produzierende Zellen zu differenzieren, welche glucoseabhängig eine regulierte Insulinsekretion zeigten (51). Nestin-positive Zellen scheinen, zumindest bei der Maus, auch mesenchymaler Herkunft zu sein (37). Dies ist insofern von Bedeutung, als mesenchymale Knochenmarkzellen sich in unterschiedlichste Gewebetypen differenzieren können (16).
Anreicherung von Pankreas-Stammzellen
Nach wie vor ist das Problem der geringen Verfügbarkeit von geeignetem Material für die b-Zell-Ersatztherapie ungelöst. Hinsichtlich ethischer Fragen und aufgrund ihrer geringen Malignität erscheinen die adulten Stammzellen im endokrinen Pankreas des Menschen zurzeit als das geeignetste Werkzeug um den Engpass, der durch die begrenzte Verfügbarkeit von Spenderorganen hervorgerufen wird, zu erweitern.
Vor dem Hintergrund der aktuellen Forschung wird in einem vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) geförderten Verbundprojekt zwischen der Medizinischen Poliklinik der Universität Würzburg (Priv.-Doz. Dr. med. J. Seufert) und dem Inseltransplantationszentrum in Gießen (Prof. Dr. med. R. Bretzel) eine b-Zell-Ersatztherapie für Typ-1-Diabetiker unter Verwendung von adulten Stammzellen aus dem Pankreas des Menschen entwickelt. Die wichtigsten frühen Phasen dieses Projekts sind die Isolation, Expansion und Differenzierung dieser Zellen. Die generelle Strategie dieses Projekts ist in Grafik 2 dargestellt.
Die bisherige Methode, Stammzellen des endokrinen Pankreas in vitro durch Einzelzellklonierung singulärer Zellen zu isolieren, ist langwierig und quantitativ unbefriedigend (51). Daher soll die Aufreinigung dieser Zellen durch zwei neue Ansätze wesentlich effektiver werden. Zum einen kann man das Filamentprotein Nestin als spezifischen Marker nutzen. Ferner können dispergierte humane Inselzellen mit Vektorkonstrukten transfiziert werden, die aufgrund spezifischer Sequenzen für den Nestin-Promotor und das für die Gewebespezifität im ZNS verantwortliche zweite Intron des Nestin-Gens (50) ausschließlich in Nestin-positiven Zellen aktiv sind. Über Resistenzgene in diesen Konstrukten können die Nestin-positiven Zellen spezifisch aus Inselzellkulturen selektioniert werden. Alternativ wird versucht, diese Zellen mit Antikörpern gegen die spezifischen Oberflächenproteine ABCG2 („ATP-binding cassette transporter 2“) und MDR1 („P-glycoprotein pump“) aufzureinigen (21).
Nach der Selektion müssen die Stammzellen in vitro vermehrt werden. Da adulte Stammzellen sich bislang nur schlecht in vitro expandieren ließen, sollen regulierbare Vektorsysteme mit kodierenden Sequenzen für proliferationsassoziierte Faktoren, die bereits im Rahmen des Projekts identifiziert wurden, das Wachstum der Zellen verstärken. Ist eine stabile Zellkultur etabliert, können diese Zellen in Insulin produzierende b-Zellen differenziert und anschließend im Tiermodell immunologisch und funktionell charakterisiert werden. Weiterhin soll die Bildung inselartiger Strukturen mit ihren komplexen räumlichen Wechselwirkungen in der dreidimensionalen Zellkultur, dem „tissue engineering“, optimiert werden, um die biologischen Funktionen dieser künstlichen Pankreasinseln zu verbessern (bioartifizielles Pankreas).
Ausblick
In der Zukunft wird es vielleicht möglich sein, adulte Stammzellen des Pankreas unbegrenzt in vitro zu vermehren und in glucosesensitive b-Zellen beziehungsweise Pankreasinseln zu differenzieren, welche dann ähnliche Eigenschaften wie die endogenen b-Zellen besitzen. Transplantatbedingte und autoimmunologische Probleme könnten durch Generierung von Stammzelllinien mit jeweils empfängerspezifischem AB0- und HLA-Typus gelöst werden. Möglicherweise bedeutet dann in einigen Jahren die Diagnose Typ-1-Diabetes für den Patienten nicht mehr lebenslang mit einer unheilbaren Krankheit behaftet zu sein.

Manuskript eingereicht: 14. 1. 2003, revidierte Fassung angenommen: 31. 3. 2003

zZitierweise dieses Beitrags:
Dtsch Arztebl 2003; 100: A 1604–1611 [Heft 23]

Die Zahlen in Klammern beziehen sich auf das Literaturverzeichnis, das beim Verfasser erhältlich oder im Internet unter www.aerzteblatt.de/lit2303 abrufbar ist.

Anschrift für die Verfasser:
Priv.-Doz. Dr. med. Jochen Seufert
Schwerpunkt Stoffwechsel, Endokrinologie
und Molekulare Medizin
Medizinische Poliklinik der Universität Würzburg
Klinikstraße 6–8
97070 Würzburg
E-Mail: j.seufert@mail.uni-wuerzburg.de
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