ArchivDeutsches Ärzteblatt10/2006Kolorektales Karzinom: Frühdiagnose durch Nachweis von Tumor-DNA im Stuhl

MEDIZIN

Kolorektales Karzinom: Frühdiagnose durch Nachweis von Tumor-DNA im Stuhl

New approaches to diagnosing colorectal carcinoma: detection of tumour DNA in stool samples

Dtsch Arztebl 2006; 103(10): A-623 / B-534 / C-514

Tschentscher, Peter; Wagener, Christoph

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Zusammenfassung
Der Nachweis von Tumor-DNA in Stuhlproben ist ein neuer Ansatz, um die bisher unzureichende Frühdiagnostik kolorektaler Karzinome im Rahmen des Screenings zu verbessern. DNA aus kolorektalen Adenomen oder Karzinomen kann anhand typischer Mutationen oder Methylierungsveränderungen im Stuhl erkannt werden. Für einen empfindlichen Nachweis veränderter DNA in einem hohen Überschuss an normaler DNA stehen im Prinzip geeignete molekularbiologische Methoden zur Verfügung. Sie müssen jedoch so weiter entwickelt werden, dass sie als kostengünstige Routinemethode für das Screening einsetzbar sind. Um vorhandene Tumoren in einer frühen Phase der Karzinogenese sicher zu erfassen, muss die richtige Kombination geeigneter Marker und Methoden gefunden werden. Nur ein Stuhl-DNA-Test mit hoher diagnostischer Sensitivität könnte in Zukunft die Koloskopie als empfohlene Screeningmethode ersetzen.

Schlüsselwörter: Kolorektalkarzinom, Krebsdiagnostik, molekulare Medizin, Genmutation, DNA-Methylierung, Stuhltest

Summary
New approaches to diagnosing colorectal carcinoma: detection of tumour DNA in stool samples
Detection of tumour DNA in stool is a new screening approach aimed at improving the early diagnosis of colorectal cancer. DNA from colorectal adenomas or carcinomas can be detected using specific mutations or methylation patterns. Altered DNA can in principle be detected in a high excess of normal DNA with high sensitivity, but low cost routine screening assays have yet to be developed. The combination of markers and methods must be refined to detect early stage tumours reliably. Only a test with high sensitivity could replace colonoscopy as the recommended screening method in the future.

Key words: colorectal carcinoma, cancer diagnosis, molecular medicine, gene mutation, DNA methylation, stool test

Bösartige Tumoren des Dickdarms sind eine der häufigsten Krebserkrankungen bei Männern und Frauen weltweit (1). Sie treten überwiegend in höherem Lebensalter auf, wachsen langsam und häufig zunächst symptomlos. Tumormarker im Blut wie CEA oder CA 19-9 sind für eine Erstdiagnose aufgrund mangelnder Spezifität und Sensitivität ungeeignet. Die Prognose für eine erfolgreiche Therapie hängt entscheidend vom Tumorstadium zum Zeitpunkt der Diagnose ab: Sind bereits Tumorzellen systemisch metastasiert, ist eine kurative Behandlung in der Regel nicht möglich. Die Diagnose erfolgt zurzeit durch die Endoskopie und eine histologische Beurteilung der gewonnenen Biopsien. Die damit verbundenen physischen und psychischen Belastungen sowie – wenn auch selten auftretende – Komplikationen vermindern die Bereitschaft vieler Patienten, die Endoskopie im Rahmen des empfohlenen Screenings durchführen zu lassen.
Stuhluntersuchungen auf okkultes Blut sind bisher die am weitesten verbreitete Screeningmethode für das kolorektale Karzinom. Der Test kostet wenig, ist einfach zu handhaben und belastet den Patienten nicht, weil das Probenmaterial leicht verfügbar ist. Er weist Hämoglobin und dessen Abbauprodukte im Stuhl nach, allerdings ohne die Herkunft des Blutes zu berücksichtigen. Blutungen aus Divertikeln, Hämorrhoiden oder minimalen Läsionen im Gastrointestinaltrakt führen ebenso zu positiven Befunden wie bestimmte Nahrungsbestandteile. Allerdings bleiben Adenome oder Karzinome in einem blutungsfreien Intervall unerkannt. Selbst in Kombination mit einer Sigmoidoskopie reicht dieser Test für eine sichere Krebsfrüherkennung nicht aus (2).
Um die diagnostische Effizienz von Stuhluntersuchungen zum Nachweis kolorektaler Karzinome zu erhöhen, wurden in den letzten Jahren auch molekularbiologische Methoden eingesetzt. Dabei werden Nukleinsäuren aus Tumorzellen nachgewiesen, die in den Stuhl gelangt sind. Diese kommen im Vergleich zu Nukleinsäuren aus der Nahrung und aus Bakterien der Darmflora nur in geringen Konzentrationen vor.
Um eine Tumorzelle nachzuweisen, ist ein charakteristisches Merkmal erforderlich, das die Tumorzelle von den normalen Zellen des Patienten unterscheidet. Zur Unterscheidung können tumorspezifische DNA-Mutationen und Veränderungen der DNA-Methylierung sowie die Bildung bestimmter Proteine oder mRNA-Profile dienen. Um die künftige Bedeutung solcher Untersuchungen für die klinische Diagnostik einschätzen zu können, werden im Folgenden molekularbiologische Methoden für einen Tumorzellnachweis beschrieben, die grundsätzlich für eine Frühdiagnose kolorektaler Karzinome geeignet sind.
Tumorspezifische DNA-Mutationen im Stuhl
Die DNA kolorektaler Tumorzellen weist Mutationen auf, die Onkogene aktivieren oder Tumor-Suppressorgene inaktivieren und so eine verstärkte Proliferation oder verlängerte Lebensdauer der betroffenen Zellen verursachen. DNA mit solchen Mutationen kann auch im Stuhl von Tumorpatienten nachgewiesen werden. Die dafür eingesetzten Methoden müssen kleinste Mengen Tumor-DNA auch dann sicher erfassen, wenn ein hoher Überschuss an normaler DNA vorliegt, die aus der gesunden Kolonschleimhaut oder anderen Körperzellen des Patienten stammt. Deshalb ist es erforderlich, die mutierte DNA in einem hundert- bis tausendfachen Überschuss normaler DNA nachzuweisen.
Nur wenige Methoden erreichen die erforderliche Nachweisgrenze und sind dabei so praktikabel, dass sie in unterschiedlichen Variationen für die Analyse von Stuhl-DNA verwendet werden können: Bei der allelspezifischen Amplifikation (3) (Grafik 1a) passt ein PCR-Primer zur mutierten Sequenz. Die Reaktionsbedingungen werden so gewählt, dass nur die mutierte Sequenz angereichert wird. Auch mit dem Oligonukleotid-Ligations-Assay (4) (OLA), der auch Mismatch-Ligations-Assay (MLA) genannt wird (Grafik 1b), kann gezielt mutierte DNA in einem hohen Überschuss normaler DNA nachgewiesen werden. Mit der Mutant-enriched PCR (5) (Grafik 1c) wurden im Stuhl von Karzinompatienten diejenigen Mutationen gefunden, die im Primärtumor vorhanden waren (6). Diesen Methoden ist gemeinsam, dass die nachzuweisenden Mutationen vorher bekannt sein und die Reaktionsbedingungen für jede einzelne Mutation speziell entworfen werden müssen.
Ein grundsätzlich anderes Vorgehen zum Auffinden mutierter DNA besteht bei der subtraktiven iterativen PCR (7) (siPCR) (Grafik 2). Bei dieser in den letzten Jahren entwickelten Methode wird zunächst der Überschuss an normaler DNA reduziert. Die Nachweisgrenze der siPCR wurde mit 1:10 000 (mutierte DNA im Verhältnis zu normaler DNA) berechnet (8). Die Methode ist damit für die Frühdiagnose kolorektaler Karzinome im Stuhl gut geeignet. Darüber hinaus ist die siPCR für den Nachweis jeder beliebigen Punktmutation in gleicher Weise einsetzbar, wobei die Mutation im Voraus nicht bekannt sein muss.
Zellisolierung aus
Stuhlproben
In Stuhlproben sind auch intakte Kolonepithelzellen vorhanden, die für eine Diagnostik gastrointestinaler Erkrankungen isoliert werden können (9, 10). Einigen Autoren zufolge werden täglich ein Drittel bis ein Sechstel der 5 X 1010 Kolonepithelzellen abgeschilfert und mit dem Stuhl ausgeschieden (11). Bei einem Tumor würde – je nach Tumorgröße – ein entsprechender Anteil aus Tumorzellen bestehen. Tatsächlich konnten im Stuhl von Kolonkarzinompatienten mit hoher Zuverlässigkeit Tumorzellen mikroskopisch nachgewiesen werden, die anhand von Oberflächenproteinen immunchemisch gefärbt wurden (12). Allerdings bezog sich diese Studie ausschließlich auf bereits symptomatische Patienten. Es ist zu befürchten, dass lichtmikroskopische Methoden für die Frühdiagnostik kleinster Tumoren nicht empfindlich genug sind.
Statt der Oberflächenproteine können auch die Nukleinsäuren der aus dem Stuhl isolierten Epithelzellen untersucht werden. Zunächst wurde angenommen, dass dieses Vorgehen gegenüber einer Präparation der gesamten Nukleinsäuren Vorteile bietet, weil DNA und RNA durch eine intakte Zellmembran vor Abbauprozessen im Stuhl geschützt und störende Nukleinsäuren aus der Nahrung und Bakterien der Darmflora entfernt werden. Für die DNA haben vergleichende Untersuchungen jedoch gezeigt, dass die Zellisolierung gegenüber einer Präparation der gesamten Stuhl-DNA keinen Vorteil besitzt (13). Zudem hat sich herausgestellt, dass die präparierbaren RNA-Mengen sehr gering sind. Die Hauptursache für beide Befunde scheint zu sein, dass intakte Epithelzellen in dem angenommenen Umfang im Stuhl gar nicht vorhanden sind. Neuere Modelle zur Regeneration der Darmschleimhaut beschreiben, dass die Epithelzellen überwiegend nicht abgeschilfert und mit dem Stuhl ausgeschieden, sondern in einem kontrollierten Prozess wieder in die Schleimhaut aufgenommen und dort phagozytiert werden (14).
Tumorspezifische Genmethylierungen im Stuhl
Da sich die Bemühungen um ein verbessertes Screening für kolorektale Karzinome nunmehr auf den Nachweis von Tumor-DNA im Stuhl konzentrieren, sind neben den klassischen Mutationen auch DNA-Methylierungen interessant (15). Diese so genannten epigenetischen Veränderungen kommen zustande, indem entsprechende Enzyme eine Bindung von Methylgruppen an Cytosinreste der DNA vermitteln. Methylierungen in der Promotorregion zellulärer Gene unterbinden deren Transkription und beeinflussen so die Zellaktivität. Beim kolorektalen Karzinom sind die Promotoren einiger Gene im Vergleich zum Normalgewebe hypermethyliert.
Durch eine Behandlung der DNA mit Bisulfit (16) können Cytosinreste in Uracil umgewandelt werden (Grafik 3). Die Umwandlung ist chemisch jedoch nicht möglich, wenn das Cytosin eine Methylgruppe trägt. Die Bisulfit-Konversion überträgt damit das Methylierungsmuster in eine Veränderung der Basensequenz, die erkennen lässt, ob das Cytosin an einer bestimmten Position der DNA methyliert war. Eine häufig eingesetzte Methode zur Untersuchung der DNA-Methylierung ist die methylierungsspezifische PCR (MSP). Sie entspricht einer allelspezifischen PCR (Grafik 1a), nachdem eine Bisulfit-Konversion (Grafik 3) erfolgte. Die Primer binden an die Sequenz, die sich nach der Bisulfit-Modifikation aus dem gesuchten Methylierungsmuster ergibt (16). Die Nachweisgrenze wird mit einem methylierten DNA-Molekül auf 1 000 normale Moleküle angegeben. Die MSP sollte damit ebenso wie die siPCR für den Nachweis von Tumor-DNA im Stuhl geeignet sein.
Diagnostische Effizienz eines Stuhl-DNA-Screenings
Für ein erfolgreiches molekularbiologisches Screening müssen möglichst alle malignen Veränderungen der Darmschleimhaut erfasst werden. Da kolorektale Tumoren wie viele andere Tumorarten genetisch heterogen sind, ist nicht die Erfassung einzelner, sondern nur einer Kombination mehrerer Mutationen erfolgversprechend. In der bisher größten Studie hierzu wurden 21 verschiedene Mutationen mit unterschiedlichen Methoden nachgewiesen (17). Die Studie umfasste 4 404 nicht symptomatische Personen über 50 Jahre mit einem normalen Karzinomrisiko. Die Teilnehmer stellten eine Probe für die Stuhl-DNA-Untersuchung zur Verfügung, verwendeten drei Haemoccult-Karten und ließen eine Koloskopie durchführen. Von den durch die Koloskopie entdeckten 31 invasiven Karzinomen wurden mit der DNA-Untersuchung 16 (51,6 Prozent) und damit deutlich mehr Erkrankungen erkannt als mit dem Haemoccult-Test (4 Karzinome, 12,9 Prozent). Von den 71 fortgeschrittenen Neoplasien (invasive Karzinome und hochgradig dysplastische Adenome) entdeckte der DNA-Test 29 Erkrankungen (40,8 Prozent), der Haemoccult-Test 10 (14,1 Prozent). Demnach besteht bei einem Patienten mit einer fortgeschrittenen Neoplasie des Kolons eine Wahrscheinlichkeit von etwa 86 Prozent, dass die Erkrankung mit dem Haemoccult-Test übersehen wird. Mit einer DNA-Untersuchung wäre das Risiko zurzeit immer noch etwa 59 Prozent.
Im Prinzip kommen zwei Ursachen dafür infrage, dass Neoplasien bei einer DNA-Untersuchung nicht erkannt werden: Erstens, die in den Stuhlproben befindliche Menge an Tumor-DNA liegt unterhalb der Nachweisgrenze der eingesetzten Methode. In diesem Fall kann die Sensitivität gegebenenfalls verbessert werden, indem die Nachweisgrenze durch methodische Veränderungen herabgesetzt wird. Zweitens können die gesuchten Mutationen in den Tumoren gar nicht vorhanden sein. In diesem Fall lässt sich das Stuhl-DNA-Screening nur durch den Nachweis zusätzlicher oder anderer Mutationen verbessern. Ein Vorteil gegenüber DNA-Mutationen scheint zu sein, dass Methylierungsveränderungen bei bestimmten Tumorarten deutlich häufiger vorhanden und in relativ kurzen Sequenzbereichen – den Promotor-Sequenzen – zu finden sind. In einer neueren Studie (18) reichte die Untersuchung der Promotoren von fünf Genen aus, um in jedem Tumor mindestens eine Hypermethylierung zu finden. In den meisten Fällen konnten die hypermethylierten Sequenzen auch im Stuhl der Karzinompatienten nachgewiesen werden.
In der Studie zum Stuhl-DNA-Screening (17) lag die diagnostische Spezifität der DNA-Untersuchung mit 94,4 Prozent in etwa so hoch wie beim Haemoccult-Test (95,2 Prozent). Demnach besteht bei einer gesunden Person mit beiden Methoden jeweils ein Risiko von etwa 5 Prozent, dass ein falschpositiver Befund erhoben wird. Positive DNA-Befunde bei Personen ohne Tumorerkrankung können analytische oder biologische Ursachen haben: Bei PCR-Methoden führt zum Beispiel die natürliche Fehlerrate der DNA-Polymerase nach einer kritischen Anzahl an Reaktionszyklen regelmäßig zum Auftreten von artefiziellen Mutationen, die nicht von echten Mutationen in der Patientenprobe zu unterscheiden sind. Andererseits kann in Patientenproben tatsächlich mutierte DNA vorhanden sein, ohne dass klinisch relevante Neoplasien erkennbar wären. Ein gutes Beispiel hierfür ist das Vorkommen von Pankreaskarzinom-typischen Mutationen im Pankreasgewebe bei chronischer Pankreatitis, die dann auch im Pankreassekret zu finden sind (8). Im Kolon treten ebenfalls Mutationen auf, ohne dass ein Adenom oder Karzinom vorhanden ist. Diese Form der Unspezifität lässt sich auch bei methodischen Verbesserungen eines Screeningverfahrens nicht vermeiden.
Zukunft des Stuhl-DNA-Screenings
Obwohl die Stuhl-DNA-Untersuchung, bezogen auf fortgeschrittene Neoplasien, die Sensitivität von 14,4 Prozent beim Hämoccult-Test auf mehr als 40 Prozent erhöhen würde, ist eine weitere Steigerung der Sensitivität erforderlich, wenn sie die Koloskopie als Screeningmethode ersetzen soll. Möglich wäre dies, indem die Kombination der nachzuweisenden Mutationen verbessert, die Methylierungsveränderungen einbezogen oder neue Methoden wie die siPCR eingesetzt würden.
Die Weiterentwicklung und der breite Einsatz einer Methode vermindern erfahrungsgemäß zugleich die Kosten für den einzelnen Test. Die Stuhl-DNA-Untersuchung kostet zurzeit 400 bis 800 US-Dollar und ist für eine
Routinediagnostik deutlich zu teuer (19). Mit jeder Steigerung der Sensitivität eines diagnostischen Tests geht in der Regel ein Verlust an Spezifität einher.
Unspezifische, das heißt falschpositive Befunde sind daher ein typisches Merkmal von Screeninguntersuchungen, die eine größtmögliche diagnostische Sensitivität besitzen sollen, um keinen Kranken zu übersehen. Jeder positive Befund im Rahmen eines Stuhl-DNA-Screenings wäre aus diesem Grund auch in Zukunft durch eine Koloskopie zu bestätigen oder als falschpositiv einzustufen. Die für die Patienten belastende koloskopische Untersuchung müsste aber bei erfolgreicher Entwicklung eines zuverlässigen DNA-Screenings nur noch für die positiv getesteten Personen und nicht mehr als primäre Screeningmethode für die gesamte Bevölkerung empfohlen werden.

Manuskript eingereicht: 28. 6. 2005, revidierte Fassung angenommen: 29.8. 2005

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt im Sinne der Richtlinien des International Committee of Medical Journal Editors besteht.

zZitierweise dieses Beitrags:
Dtsch Arztebl 2006; 103(10): A 623–8.

Anschrift für die Verfasser:
Dr. med. Peter Tschentscher
Institut für Klinische Chemie
Zentrum für Klinische Pathologie
Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf
Martinistraße 52
20246 Hamburg
E-Mail: tschentscher@uke.uni-hamburg.de
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