ArchivDeutsches Ärzteblatt39/2007Kryobanken: Tiefkühlarchiv für die Forschung

THEMEN DER ZEIT

Kryobanken: Tiefkühlarchiv für die Forschung

Dtsch Arztebl 2007; 104(39): A-2634 / B-2325 / C-2257

Hibbeler, Birgit; Krüger-Brand, Heike E.

Als E-Mail versenden...
Auf facebook teilen...
Twittern...
Drucken...
LNSLNS
Blick in die Kryolagerhalle: Die aus Edelstahl gefertigten Kryolagertanks sind an die automatische Versorgung mit flüssigem Stickstoff angeschlossen. Jeder Behälter ist außerdem mit einem Überwachungs-PC ausgestattet.
Blick in die Kryolagerhalle: Die aus Edelstahl gefertigten Kryolagertanks sind an die automatische Versorgung mit flüssigem Stickstoff angeschlossen. Jeder Behälter ist außerdem mit einem Überwachungs-PC ausgestattet.
In Sulzbach/Saarland befindet sich eines der weltweit modernsten Zentren für die Tiefkühlkonservierung von biologischen Proben. Seit Mitte 2006 wird dort außerdem eine internationale Kryobank für die HIV-Impfstoffforschung aufgebaut.

Der Wunsch, das geliebte Haustier oder gar sich selbst zwecks späterer Wiederbelebung einfrieren zu lassen, scheint nicht ungewöhnlich zu sein. So gibt es zum Beispiel in den USA bereits Fälle von Tieftemperaturkonservierung von Menschen nach dem natürlichen Tod. Vereinzelte Anfragen dieser Art habe auch das Fraunhofer-Institut für Biomedizinische Technik (IBMT) in St. Ingbert schon erhalten, berichtet Institutsdirektor Prof. Dr. Günter Fuhr. Für den Biophysiker gehört dieser Aspekt der Kryokonservierung jedoch eindeutig zur Science-Fiction und hat keinerlei wissenschaftlichen Hintergrund. Das IBMT hat sich auf dem Gebiet der Kryokonservierung – der Lagerung von Zellen und Gewebestücken bei Temperaturen unter -130 °C (Kasten) – und beim Aufbau von Kryobanken innerhalb kurzer Zeit einen Namen gemacht. Seit Ende 2003 betreibt das Institut am Standort Sulzbach im Saarland eine der modernsten Kryobanken für biologische, landwirtschaftliche und medizinische Proben.
Weltweit steigt der Bedarf an Kryobanken, denn eine effiziente, weitgehend automatisierte und sichere Aufbewahrung von biologischem Material wird künftig immer wichtiger, nicht nur für die industrielle Biotechnologie, sondern auch für die patientenorientierte klinische Forschung etwa im Rahmen der regenerativen Medizin. „Die Kryotechnologie ist eigentlich gut entwickelt“, sagt Fuhr. Doch in der Biobanken-Szene sei das noch nicht angekommen, hier habe die Gefriertechnologie mit den wachsenden Anforderungen nicht Schritt gehalten. „Der Trend geht zu Großbanken“, ist Fuhr überzeugt, denn erst bei diesen lohne es sich, in die Automatisierung zu investieren, um große Probenmengen zu bewältigen und ein hohes Qualitäts- und Sicherheitsniveau zu gewährleisten. Deshalb hat man beim IBMT die gesamte Prozesskette – von der Probenaufbereitung über kontrollierte Einfrier-, Entnahme- und Auftauverfahren bis zum Versand von Lebendproben – optimiert und ein umfassendes Kryotechnologiekonzept entwickelt.
Nähert man sich dem unauffälligen IBMT-Flachbau im Sulzbacher Industriegebiet, sticht sofort ein heller Kühlbehälter ins Auge, der meterhoch in den Himmel ragt. Er ist mit rund 25 000 Litern flüssigem Stickstoff gefüllt und speist die in einer großen Halle auf Rollen gesetzten Kryotanks, in denen die Proben gelagert werden. Die mannshohen Tanks aus Edelstahl enthalten jeweils zwei ineinandermontierte und durch einen Vakuumbereich thermisch isolierte Behälter. Die Temperatur in den Tanks wird elektronisch überwacht, jeder Zugriff protokolliert.
Klassisches Kryoröhrchen für Zellsuspensionen, etwa in der Originalgröße
Klassisches Kryoröhrchen für Zellsuspensionen, etwa in der Originalgröße
Fortschreitende
Miniaturisierung
Eine wesentliche Besonderheit der Fraunhofer-Technologie sind die miniaturisierten Zellcontainer, die auch eine Teilentnahme von Probenmaterial ermöglichen. Dies ist wichtig, wenn man sich klarmacht, dass auf einem Kubikmillimeter – einer Fläche, die kleiner ist als ein Stecknadelkopf – zum Beispiel 100 000 Stammzellen Platz haben. Damit bei Entnahmen von Zell- und Gewebeproben nicht mehr Material entnommen und aufgetaut werden muss, als tatsächlich für Analysen gebraucht wird, hat das IBMT kleine stapelbare Probenträger (Substrate) entwickelt, die sich auf speziellen Metallregalen (Racks) zusammenschieben lassen. In einer einzigen Kuhle solcher Substrate finden eine Million Zellen Platz. Im Kryotank selbst können bei einer Temperatur von -152 °C in der Gasphase rund 10- bis 70 000 solcher Substrate gelagert werden, das heißt, in jedem Kühltank lassen sich mehrere Millionen Proben aufbewahren.
Zur Verwaltung der Proben ist die Materialbank direkt mit einer Datenbank verbunden. „Als zweite Neuerung neben der Miniaturisierung haben wir die Substrate mit Speicherchips versehen“, erklärt Fuhr. „Die Chips haben wir so modifiziert – und dies auch patentieren lassen –, dass sie bis -180 °C gelesen und beschrieben werden können.“ Sie enthalten alle wichtigen Informationen, wie etwa die Herkunft der Probe, Analysewerte, Bilddokumentationen und verwendete Datenformate. Per RFID, Barcode und über die Chips, die über ein Leitungssystem angesteuert werden können, lassen sich die Substrate eindeutig identifizieren. Wird zum Beispiel eine Probe falsch abgelegt, wird das automatisiert registriert. Durch diese verwechslungssichere Integration von Proben und Daten erweitern sich die Möglichkeiten bei der Lagerhaltung: So können beispielsweise unterschiedliche Probentypen eines Menschen zusammen eingelagert werden, man kann aber auch nach Probentypus – Blut, Serum, Viren, Zellkulturen – unterschiedlichen Ursprungs sortieren, wenn für eine wissenschaftliche Untersuchung nur ein bestimmtes Material benötigt wird. Dafür ist jedoch eine differenzierte Datenbankarchitektur erforderlich, die einen automatischen Abgleich mit den dezentral in den Kryotanks gelagerten Speicherchips ermöglicht.
Kryotaugliche elektronische Speicherchips, die in flüssigem Stickstoff (-196 °C) störungsfrei arbeiten.
Kryotaugliche elektronische Speicherchips, die in flüssigem Stickstoff (-196 °C) störungsfrei arbeiten.
Anzeige
Entnähme man Probenmaterial ungeschützt aus den Tanks, würde dieses innerhalb von drei Minuten bereits kritische Temperaturen von rund -50 °C erreichen. „Die Probe muss immer eiskalt bleiben und darf nicht beschlagen“, erläutert Fuhr. Für die Entnahme von Proben haben die Forscher deshalb spezielle Turmaufsätze für die Kryotanks entwickelt, die bis auf -100 °C mit Stickstoff heruntergekühlt werden können. Sie schützen die Tanks vor Vereisung und verhindern, dass die gelagerten Proben bei der Entnahme durch Fremdeinflüsse beschädigt werden. Auch für den Transport der Proben werden speziell entwickelte, ebenfalls mit Stickstoff gekühlte Behälter verwendet, um so eine lückenlose Kühlkette aufrechtzuerhalten.
Bisher gibt es allerdings kein Verfahren, bei dem 100 Prozent der Zellen die Einfrier- und Auftauprozedur überleben. Gut sind Überlebensraten von 50 oder auch 80 Prozent. Es gibt jedoch auch sehr empfindliche Zellsorten. Ein Beispiel dafür sind humane embryonale Stammzellen aus den Zelllinien vor 2002, für die der US-amerikanische Vertreiber Überlebensraten von nur rund ein bis 0,1 Prozent angibt. Eine Lebendkonservierung der Proben ist ohne Zugabe von Gefrierschutzmittel, wie zum Beispiel Glycerin oder Dimethylsulfoxid, nicht möglich. Daher ist ein wesentlicher Forschungsbereich die Entwicklung von geeigneten physiologischen Kryoprotektiva. Dieser Frostschutz muss nach dem Auftauen der Zellen schnell ausgewaschen werden, weil er toxisch ist und Messergebnisse im Rahmen von Studien verfälschen könnte. „Stammzellen sind wie rohe Eier“, sagt Priv.-Doz. Dr. phil. nat. Hagen von Briesen. Schon geringer mechanischer Stress könne Zellfunktionen verändern, so der Immunologe und Virologe.
Förderprojekt der Bill-und-Melinda-Gates-Stiftung
Das IBMT hat in der Kryokonservierung eine Vorreiterrolle – auch international. Das zeigte sich nicht zuletzt im vergangenen Jahr, als die Saarländer den Zuschlag für ein ganz besonderes Projekt erhielten: In Sulzbach wird eine internationale Kryobank für HI-Viren, Immunzellen und Reagenzien aufgebaut. Das Institut nimmt somit eine zentrale Rolle in der Collaboration for Aids Vaccine Discovery (CAVD) ein. Diese von der Bill-und-Melinda-Gates-Stiftung geförderte globale Initiative soll in der bislang erfolglosen Suche nach einem HIV-Impfstoff die Wende bringen. Wenn weltweit alle Forscher an einem Strang ziehen, so die Hoffnung, könnte es in etwa zehn Jahren eine Vakzine gegen die Immunschwächekrankheit geben.
Während sich die Experten noch darüber streiten, ob dieser Zeitplan realistisch ist, steht schon jetzt fest, dass es sich um ein Mammutprojekt handelt. In der CAVD sind 16 Konsortien aus aller Welt beteiligt. Jedes von ihnen besteht wiederum aus zehn bis 20 Partnern. „Da kommen etwa 170 Wissenschaftler aus 19 Ländern zusammen“, sagt von Briesen, der den Aufbau der HIV-Kryobank in Sulzbach leitet. Allein seine Arbeitsgruppe hat 13 direkte nationale und internationale Partner. Dazu zählen unter anderem die Welt­gesund­heits­organi­sation und die Universität Lund in Schweden. Hinzu kommen Arbeitsgruppen, die für die Sammlung von HIV-Proben und spätere Testung von Impfstoffen zuständig sind – in Südafrika, Uganda, Russland, Brasilien und Thailand.
Zellen nach einem vollständigen Einfrier- und Auftauvorgang (digital eingefärbte Aufnahme mit dem Rasterelektronenmikroskop). Die rot eingefärbte Zelle weist deutliche, irreparable Kryoschäden auf.
Zellen nach einem vollständigen Einfrier- und Auftauvorgang (digital eingefärbte Aufnahme mit dem Rasterelektronenmikroskop). Die rot eingefärbte Zelle weist deutliche, irreparable Kryoschäden auf.
Wenn die Suche nach einem Impfstoff erfolgreich sein soll, dann müssen zunächst einmal HI-Viren systematisch gesammelt und analysiert werden. Von besonderem Interesse sind dabei die Proben von Frühinfizierten. Nur aus ihnen kann man die Viruspopulation isolieren, gegen die sich ein Impfstoff richten muss. Denn die HI-Viren verändern mit Fortschreiten der Infektion unter dem Einfluss des Immunsystems ihre Eigenschaften. Die Vakzine muss also gegen die Erreger wirksam sein, die direkt nach der Ansteckung anzutreffen sind. Idealerweise sollten die Proben deshalb von Frühinfizierten stammen, die erst seit wenigen Tagen oder Wochen Virusträger sind. „Das ist eine Riesenherausforderung“, weiß auch von Briesen. Schließlich handelt es sich um das diagnostische Fenster, in dem in der Regel noch keine Antikörper nachzuweisen sind. Infrage kommen deshalb in erster Linie Patienten nach Unfällen, Verletzungen und ungeschütztem Geschlechtsverkehr, bei denen eine Infektion wahrscheinlich ist. Wenn sich nach drei Monaten der Verdacht bestätigt, können die Proben für die Impfstoffsuche verwendet werden. „Obwohl es Millionen Neuansteckungen gibt, besteht ein Mangel an brauchbaren Proben von Neuinfizierten“, sagt Fuhr. Dieses Problem will nun die CAVD angehen, mit dem zentralen Sammelort Sulzbach.
Eine internationale Vernetzung in der Impfstoffforschung hat aber nur dann Sinn, wenn alle Beteiligten bei der Aufarbeitung der Proben nach denselben Standards vorgehen. „Die Arbeitsgruppen müssen zunächst in der Kryotechnologie geschult werden“, betont von Briesen. Gemeinsam müssten Strategien entwickelt werden, wie die Technologie auch in Entwicklungsländern betrieben werden könne. Die Kette vom Patienten in den Tank vor Ort, über die Versendung in sogenannten Kryobomben bis hin zur endgültigen Einlagerung in Deutschland soll nach einer einheitlichen Methodik ablaufen.
Mikro-Kryocontainer aus Silizium zur Aufnahme und späteren Fraktionierung von Suspensionströpfchen mit Zellen. In einem solchen Tropfen befinden sich bis zu zehntausend Zellen. Fotos: Fraunhofer-IBMT
Mikro-Kryocontainer aus Silizium zur Aufnahme und späteren Fraktionierung von Suspensionströpfchen mit Zellen. In einem solchen Tropfen befinden sich bis zu zehntausend Zellen. Fotos: Fraunhofer-IBMT
Die im Saarland eingelagerten Proben können in der Folge von den Forschern, die an der CAVD beteiligt sind, angefordert werden. Aber auch externe Wissenschaftler haben die Möglichkeit, einen Antrag zu stellen. „Das ist eine globale Initiative, die nicht in einem Kokon hängen bleiben soll“, stellt von Briesen klar.
Aber ist die Vorstellung überhaupt realistisch, in wenigen Jahren einen Impfstoff zu entwickeln? Und wird es überhaupt einen einzigen, weltweit wirksamen Impfstoff geben? Bei diesen Fragen will sich von Briesen nicht festlegen. Wichtiger für ihn ist es zunächst einmal, dass der Grundstein für eine erfolgreiche Forschung gelegt wird: Im November findet ein internationaler Workshop im Saarland statt, im Rahmen dessen die Beteiligten aus aller Welt in der Kryotechnologie geschult werden. Die ersten HIV-Proben erwartet der Virologe unterdessen bereits im Herbst aus Südafrika. Dort seien die Partner technologisch schon sehr weit.
Die Initiative zur Entwicklung eines HIV-Impfstoffs ist ein Projekt der Superlative. Rund 280 Millionen US-Dollar stellt die Bill-und-Melinda-Gates-Stiftung für die CAVD zur Verfügung. Damit handelt es sich um die bislang größte private Spende für die Aidsforschung. Für die Sulzbacher Kryobank spendet die Stiftung rund 7,5 Milionen US-Dollar. Trotz der großen Summe mische sich aber der Geldgeber in die Forschung nicht ein, versichert man in Sulzbach. Zusätzliche Fördermittel in Höhe von 475 000 Euro kommen von der Saarländischen Landesregierung. Die Fraunhofer-Gesellschaft beteiligt sich mit 870 000 Euro. Das Projekt ist zunächst auf drei Jahre angelegt und bislang das erste, das die Gates-Stiftung in Deutschland fördert.
Der Vorratsbehälter speichert 25 000 Liter flüssigen Stickstoff und dient zur Zentralversorgung der Kryoanlage.
Der Vorratsbehälter speichert 25 000 Liter flüssigen Stickstoff und dient zur Zentralversorgung der Kryoanlage.
Die HIV-Kryobank hat noch in weiterer Hinsicht eine Sonderstellung. Es gelten andere Sicherheitsvorkehrungen als für die sonstigen Kryotanks in der Sulzbacher Einrichtung. Bei HIV werden – ebenso wie bei Grippeviren – die Proben in fest verschließbaren Röhrchen gelagert. Für die CAVD-Bank gelten außerdem die Bestimmungen der Stufe S3 für Laboratorien, damit etwa im Fall einer Havarie ein Tank möglichst schnell – Ziel sind drei Minuten – umgesetzt werden kann.
Im Rahmen des Gates-Projekts entwickeln die Forscher darüber hinaus ein neues Konzept für eine Datenbankarchitektur. „Wir programmieren mit unseren Partnern auf verschiedenen Ebenen“, erläutert Fuhr. Zum einen gibt es die Verwaltungsebene der Bank, die vor dem Zugriff Außenstehender geschützt ist. Die nächste Stufe ist die Datenbankebene, in der die gesamte Sammlung dokumentiert ist. Diese kann auch von außen mit entsprechender Berechtigung abgefragt werden. Die Datenbank wird in mehrere andere große Banken weltweit eingebettet. „Damit können die Informationen besser für die Impfstoffforschung genutzt werden“, erläutert Fuhr.
Nicht für die Ewigkeit – aber für künftige Generationen
Die eingefrorenen Zellen und Substrate sind auch für sich gesehen ein Archiv – eine Sammlung biologischer Informationen, in der kommende Generationen den Ablauf der Impfstoffentwicklung nachverfolgen können. Wenn man die Proben konstant unter -130 °C hält, werden die eingelagerten Substrate nur durch kosmische Strahlung beschädigt und können viele Tausend Jahre überstehen. Nach 30 000 Jahren sei etwa 80 Prozent des Genoms einer Zelle zerstört, schätzt Fuhr. „Im Bereich von hundert oder tausend Jahren spielt die kosmische Strahlung aber keine Rolle.“
Für die Ewigkeit einlagern – das sei eher schwierig, aber sicherlich lich auch nicht die Aufgabe des Fraunhofer-Instituts, dessen Funktion vielmehr in der Technologieentwicklung liege. Trotzdem gebe es schon eine Art Verpflichtung der Menschheit, ein Archiv mit bestimmten Informationen für nachfolgende Generationen anzulegen, meint Fuhr. Ein Beispiel dafür findet man auch in Sulzbach: Eine Sammlung von Zellen wertvoller Tierrassen im Saarland, die nur noch in kleinen Beständen vorzufinden sind, lagert hier. Dieses Projekt wird vom saarländischen Umweltministerium unterstützt. In Zusammenarbeit mit dem Neunkirchener Zoopark wurde darüber hinaus eine Pilotsammlung seltener Tierarten angelegt.
Patenschaften für
Bioressourcen-Kryotanks
Für diese Kryotanks, deren Inhalt von allgemeinem Interesse ist, können Firmen und Privatpersonen Patenschaften übernehmen. Ein Tank kostet etwa 30 000 Euro, es sind aber auch Teilpatenschaften möglich. Mit dieser Förderung könne man sicherlich keine Einrichtung finanzieren, sagt Fuhr, aber mittlerweile gebe es drei Tanks mit Sicherheitskopien von Bioressourcen.
Eine Archivierung von biologischem Material in Kryobanken ist für Fuhr nichts anderes als die logische Fortsetzung einer alten Idee, die schon hinter mittelalterlichen Sammlungen in Naturalienkabinetten, Naturkundemuseen und Zoologischen Gärten steckt. „Wenn wir das Genom eines Dodos aus dem Naturkundemuseum rekonstruieren, freuen wir uns ja auch, dass die Menschen damals Dinge gesammelt haben, obwohl sie gar nicht wissen konnten, das so etwas einmal möglich sein würde“, sagt Fuhr. Umso weniger könne man vorhersagen, wozu die Sicherheitskopien in Kryobanken kommenden Generationen nutzen könnten.
Dr. med. Birgit Hibbeler
Heike E. Krüger-Brand


Kryobanken

Das griechische Wort Kryos bedeutet Kälte oder Eis.
Der Begriff bezeichnet die Lagerung von Zellen und kleinsten Gewebeteilen bei unter -130 °C, die in der Regel mittels verflüssigtem Stickstoff erfolgt. Das Lagern und Einfrieren solcher Proben ist bislang die einzige Möglichkeit, biologisches Material – tierische, pflanzliche oder menschliche Zellen und Zellverbände – über Jahrzehnte, perspektivisch sogar über nahezu beliebige Zeiträume, ohne Einbuße der Lebensfähigkeit aufzubewahren. Die Proben befinden sich in speziellen Metallregalen und Plastikbehältern, entweder in der kühlen Gasphase oder verschlossen eingetaucht in der flüssigen Kühlphase. Sämtliche Stoffwechselvorgänge der Zellen kommen für die Dauer dieser Lagerung vollständig zum Erliegen.

Leserkommentare

E-Mail
Passwort

Registrieren

Um Artikel, Nachrichten oder Blogs kommentieren zu können, müssen Sie registriert sein. Sind sie bereits für den Newsletter oder den Stellenmarkt registriert, können Sie sich hier direkt anmelden.

Fachgebiet

Zum Artikel

Anzeige

Alle Leserbriefe zum Thema