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Medizin

Basen-Editoren verursachen weitreichende Off-Target-Effekte auf RNA

Mittwoch, 3. Juli 2019

DNA-Doppelhelix mit einem aufleuchtendem Basenpaar. /ktsdesign adobe.stock.com
Die vier Basen Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T) verbinden sich in der DNA-Doppelhelix immer in AT- beziehungsweise GC-Paaren. Basen-Editoren, eine modifizierte Form des CRISPR/Cas-Systems, verändern nur eine Base und korrigieren so eine Punktmutation. /ktsdesign adobe.stock.com

Charlestown/Boston – Molekularbiologische Werkzeuge wie CRISPR/Cas gehen mit der Gefahr von Off-Target-Effekten einher. Weniger unerwünschte Veränderungen in der DNA sollen hingegen Basen-Editoren verursachen, da sie im Gegensatz zu CRISPR/Cas keine Doppelstrangbrüche verursachen.

Doch auch diese jüngere Technik, mit der künftig Punktmutationen repariert werden könnten, arbeitet noch nicht fehlerfrei. Versuche von Forschern der Harvard Medical School in Boston zeigen unerwünschte Desaminierungen bei etwa der Hälfte der exprimierten Transkripte in den untersuchten menschlichen Zelllinien (Nature 2019; doi: 10.1038/s41586-019-1161-z).

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Die initial entwickelten Cytosin-Baseneditoren (CBEs) desaminieren Cytosin zu Uracil im DNA-Strang mithilfe der Cytidin-Deaminase Ratten-APOBEC1 (rAPOBEC1), das an das Cas-Protein angehängt wird. „In menschlichen Zelllinien induzierten CBEs jedoch ebenso zehntausende unbeabsichtigte C-zu-U-Edits in RNAs mit variierender Ausprägung“, erklärt der Erstautor Julian Grünewald, Post-Doktorand am Massachusetts General Hospital und der Harvard Medical School. Unerwünschte Desaminierungen traten mit einer Frequenz von 0,07 % bis 100 % auf. 38 bis 58 % der exprimierten Gene waren ein oder mehrfach betroffen.

Der Gruppe in Harvard ist es gelungen, solche Off-Target-Effekte deutlich zu reduzieren. Mit einer CBE-Variante, die eine Mutation von rAPOBEC1 enthält, reduzierten sie die Off-Target-Effekte in der RNA um mehr als das 390-fache, mit einer zweiten Variante um mehr als das 3.800-fache. Gleichzeitig waren diese CBE-Varianten immer noch in der Lage Cytosinbasen auf DNA-Ebene effizient zu editieren.

Der Vorteil der Basen-Editoren: Der fehleranfällige Doppelstrangbruch durch die Endonuclease Cas9 wird fuer Base Editing nicht benoetigt. Stattdessen induziert eine im Basen-Editor enthaltene Deaminase eine chemische Reaktion, die das Ziel-Nukleotid direkt modifiziert. So wird beispielsweise ein C:G-Basenpaar durch ein T:A-Basenpaar ersetzt (Cytosinbasen-Editor) und umgekehrt (Adeninbasen-Editor).

„Diese Varianten dienen als Proof-of-Principle dafür, dass es möglich ist, unerwünschte RNA-Editierung zu reduzieren“, schlussfolgert Grünewald, der vor seiner Zeit in Boston, als Assistenzarzt in der Inneren Medizin und Nephrologie am Universitätsklinikum Freiburg tätig war. Seiner Ansicht nach sollte es zudem möglich sein, weitere Varianten zu identifizieren, die noch gezielter On-Target-Punktmutationen korrigieren, ohne zusätzliche RNA-Desaminierungen vorzunehmen.

Kurzfristige Eingriffe sorgen für weniger Off-Target-Effekte

Off-Target-Effekte können aber auch eingegrenzt werden, indem der Eingriff zeitlich stark reduziert wird, erläuterte die Mikrobiologin Anja Ehrhardt von der Universität Witten-Herdecke im Juni bei einer Veranstaltung im Bundesministerium für Ernährung und Landwirtschaft (BMEL).

Noch nutzen Wissenschaftler vor allem DNA, die für Basen-Editoren oder auch andere molekulartechnologische Scheren kodieren, um diese in Zellen einzuführen. „Wir sind technisch aber bereits so weit, dass wir das Protein (Basen-Editor) direkt in die Zelle einbringen können“, erläuterte Ehrhardt die Voraussetzung für einen kurzfristigen Eingriff. Weitere Forschung sei jetzt notwendig, um Off-Target-Effekte weiter einzuschränken.

Mehr als 50.000 genetische Veränderungen sind mit menschlichen Krankheiten verbunden – etwa 33.000 davon sind Punktmutationen. Bis Basen-Editoren bei diesen Menschen in Studien zum Einsatz kommen könnten, wird es vermutlich noch dauern, da die Nebeneffekte des Systems noch genauer untersucht werden müssen, sagt Ehrhardt.

David Liu spricht über Fortschritte bei molekularen Techniken /youtube, Harvard Medical School

Den ersten Basen-Editor stellten 2016 Forscher um Alexis Komor und David Liu von der Harvard University vor (Nature). Sie fusionierten eine katalytisch eingeschränkte Variante von Cas9 mit der Cytidin-Deaminase rAPOBEC1. Der Basen-Editor konnte ohne einen Doppelstrangbruch und ohne Template-DNA C:G-Basenpaare in T:A-Paare umwandeln.

Weniger Off-Target-Effekte durch Adenin-Baseneditoren

Später wurden Basen-Editoren entwickelt, die auch A:T- in G:C-Paare umwandeln konnten (sogenannte Adenin-Baseneditoren oder ABEs; Nature 2017). Auch ABEs zeigten in der aktuellen Nature-Studie transkriptomweite RNA-Off-Target-Effekte, allerdings in reduzierter Anzahl im Vergleich zu CBEs.

Zwei Forschergruppen haben bereits ABE-Varianten entwickelt. Die Gruppe um Holly Rees und David Liu vom Broad Institute und der Harvard University konnte mit ABEmaxAW eine Variante mit erheblich reduzierten RNA Off-Targets zeigen (Science Advances 2019). Auch ein Team der Chinese Academy of Sciences aus Shanghai und Peking um Changyang Zhou und Hui Yang publizierte kürzlich CBE- und ABE-Varianten mit reduzierten RNA Off-Target-Effekten (Nature 2019).  © gie/aerzteblatt.de

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