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MEDIZINREPORT

Raman-Spektroskopie: „Gefakte“ Impfstoffe aufspüren

Dtsch Arztebl 2019; 116(47): A-2192 / B-1792 / C-1749

Matheis, Walter; Bekeredjian-Ding, Isabelle

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Mit nur 10 Mikroliter Probe und statistischen Analyseverfahren kann per Raman-Spektroskopie das gemessene Spektrum dem Impfstoffprodukt eines Herstellers mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit zugeordnet werden.

Bei der Raman- Spektroskopie werden die Proben mit Laserlicht bestrahlt. Das zurückgestreute Licht wird spektroskopisch analysiert. Foto: Science Photo Library/US Department of Energy
Bei der Raman- Spektroskopie werden die Proben mit Laserlicht bestrahlt. Das zurückgestreute Licht wird spektroskopisch analysiert. Foto: Science Photo Library/US Department of Energy

In den vergangenen Jahren haben Fälle von Fälschungen und Manipulationen von Arzneimitteln Aufmerksamkeit erregt. Dabei sind hohe Preise bei monoklonalen Antikörpern, aber auch eine weltweite Verknappung von Impfstoffen die Treiber für diese kriminellen Entwicklungen. Um Fälschungen vorzubeugen, wurde in Deutschland kürzlich das securPharm-System eingerichtet. Anhand eines elektronischen Codes auf der Arzneimittelverpackung kann die Echtheit entlang der Lieferkette nachvollzogen werden (1). Ähnliche Systeme werden in ganz Europa etabliert.

Ein besonderes Problem bei biomedizinischen Arzneimitteln ist allerdings, dass die umfassende Untersuchung des Inhalts (Identität, Reinheit, Wirksamkeit) mit den im Arzneibuch vorgesehenen Prüfungen lange Zeit dauern kann. Dies betrifft insbesondere Impfstoffe, bei denen Tierversuche zur Bestätigung der spezifischen Wirksamkeit durchgeführt werden müssen. Zudem ist häufig eine Einzeldosis unzureichend, weil eine große Anzahl von Impfstoffdosen für die Analysen benötigt wird.

Bei Verdacht auf Manipulationen, die von Apotheken, Arztpraxen oder auch Patienten an die Behörden herangetragen werden, stehen jedoch oft nur wenige, nicht selten sogar nur ein Behältnis oder nur Reste für Untersuchungen zur Verfügung. Aus diesem Grund wird die Etablierung von Methoden angestrebt, die es ermöglichen, mit geringen Probenmengen Aussagen hinsichtlich der Identität, aber auch der Integrität der Arzneimittel treffen zu können. Für den Anwender wichtig ist zum Beispiel, dass bei Impfstoffen die Kühlkette gewahrt wurde, weshalb auch fehlerhafte Lagerung nach Arzneimittelgesetz als „Fälschung“ behandelt wird.

Bei der Raman-Spektroskopie werden die Proben mit Laserlicht bestrahlt. Das zurückgestreute Licht wird spektroskopisch analysiert. Dabei werden elastisch gestreute Photonen, die dieselbe Frequenz wie die eingestrahlten Laserphotonen aufweisen (Rayleigh-Strahlung), durch einen (Notch-)Filter eliminiert. Durch molekulare Schwingungen kommt es zu Frequenzverschiebungen, die für die chemische Zusammensetzung spezifisch sind (2). Dadurch entsteht ein „Fingerabdruck“ der jeweiligen Probe.

Komplexe biologische Proben

Im Bereich der chemisch gut charakterisierten Arzneimittel sind diverse spektroskopische Ansätze in der Arzneimittelanalytik etabliert (36) und werden auch zur Aufklärung von Fälschungen eingesetzt (7). Aufgrund der Komplexität von biologischen Proben ist der Routineeinsatz von spektroskopischen Methoden bislang allerdings vorwiegend auf Zwischenprodukte und In-Prozess-Kontrollen beschränkt (810). Darunter findet sich auch die Nutzung der Kernresonanzspektroskopie an Polysaccharid-Bulkmaterial für bakterielle Impfstoffe (11) oder die Raman-Spektrosokopie als Qualitätskontrollmethode in großen Fermentatoren (12). Auch bei speziellen Fragestellungen (wie der Anwesenheit einer bekannten Verunreinigung in Heparinproben) kann die NMR-Spektroskopie genutzt werden (13).

Aufgrund der Kombination von Mikroskopie und Spektroskopie sowie der Möglichkeit, große Datenmengen speichern und darauf mathematische Auswerteverfahren anzuwenden, gewinnen spektroskopische Methoden für die Untersuchung von biologischen Proben an Bedeutung. Die Raman-Mikrospektroskopie ist beispielsweise als Methode zur Identifizierung von Bakterien beschrieben. Raman-basierte Methoden sind auch für die Diagnostik von Tumorgewebe in Biopsiematerial geeignet.

Vor diesem Hintergrund wurde am Paul-Ehrlich-Institut (PEI) in Kollaboration mit dem Leibniz-Institut für Photonische Technologien die Idee entwickelt, die Eignung der Raman-Mikroskopie zur Untersuchung von Kombinationsimpfstoffen mit multiplen bakteriellen Komponenten zu testen.

Die für die Grundimmunisierung und Auffrischimpfungen routinemäßig eingesetzten Impfstoffe enthalten unterschiedliche Antigene aus unterschiedlichen Herstellungsverfahren – zum Beispiel inaktivierte Bakterientoxine, Oberflächenproteine des Erregers, Kapselpolysaccharide oder vollständige, abgeschwächte Erreger. Hinzu kommen Adjuvanzien (Aluminiumhydroxid und -phosphat) und andere Hilfsstoffe. Es handelt sich folglich um komplexe Gemische aus einer variierenden Zahl von Komponenten. Die Untersuchungen werden dadurch erschwert, dass höhere Konzentrationen an Hilfsstoffen als an Impfantigenen vorliegen.

Diskriminationsanalyse

In den kürzlich veröffentlichten Untersuchungen zur Eignung der Raman-Spektroskopie für die Identifizierung von Impfstoffen wurden verschiedene Diphtherie-Tetanus-Pertussis-(DTP-)haltige Vakzine unterschiedlicher Hersteller einbezogen, die sich je nach Indikation in der Zahl von Antigenen, den Antigenmengen und der chemischen Zusammensetzung des Adjuvans und der Hilfsstoffe unterscheiden (13).

Für den „proof of principle“ der Raman-Mikroskopie wurde eine spezielle Methode entwickelt. Dabei werden 10 Proben von je einem Mikroliter aus einem Impfstoffbehältnis auf eine Kalziumfluoridplatte aufgetragen. Nach Lufttrocknung wird jede einzelne Probe mit einem 10-mal-10-Punktraster gemessen. Methodisch bedingte Artefakte werden elektronisch entfernt, sodass man nach Kalibrierung, Basislinienkorrektur und Mittelwertbildung charakteristische Signale für die einzelnen Proben erhält (siehe Grafik).

Raman-Spektren der untersuchten DTaP-Impfstoffe
Raman-Spektren der untersuchten DTaP-Impfstoffe
Grafik
Raman-Spektren der untersuchten DTaP-Impfstoffe

Aufgrund der sehr unterschiedlichen Mengenverhältnisse von Impfantigen und Hilfsstoffen war es mit der Methode nicht möglich, die einzelnen Komponenten des Impfstoffs zu identifizieren und darüber die Zusammensetzung der einzelnen Inhaltsstoffe des Impfstoffs zu bestätigen. Allerdings zeigte sich, dass der spektrale „Fingerabdruck“ eines Impfstoffs von denen anderer mithilfe der mathematischen Diskriminationsanalyse unterschieden werden kann.

Die von den verschiedenen Impfstoffpräparaten erhaltenen Spektren können in Zukunft in einer Datenbank hinterlegt werden. Wird eine neue Probe gemessen, können die erhaltenen Signalmuster mit statistischen Verfahren analysiert werden. Auf diese Weise ist es möglich, das Spektrum einer neuen Probe einem Impfstoffpräparat automatisiert zuzuordnen und zu erkennen, ob es sich um das deklarierte Präparat handelt.

Erste orientierende Untersuchungen zeigen darüber hinaus, dass die Identifikation eines Produkts ungeachtet der Chargenvariabilität möglich ist. Vorläufige Untersuchungen deuten an, dass sich Schäden durch Fehllagerungen (Einfrieren und Erhitzen) durch charakteristische Änderungen in den Spektren feststellen lassen.

Für detailliertere Aussagen sind jedoch weitere gezielte Versuche notwendig. Daneben wird das Potenzial der Methode derzeit dahingehend evaluiert, ob es möglich ist, in flüssigen Proben charakteristische Spektren zu erhalten. Ideal wäre es, das Material in der Ampulle oder Spritze ohne Probennahme und Probentrocknung identifizieren zu können. Vorteilhaft wäre es, wenn ein benutzerfreundliches Gerät in Apotheken, bei Großhändlern, in Untersuchungsämtern zur Wareneingangskontrolle und Überprüfung von Reklamationen zum Einsatz kommen könnte.

Dr. rer. nat. Walter Matheis

Prof. Dr. med. Isabelle Bekeredjian-Ding

Paul-Ehrlich-Institut, Langen

Interessenkonflikt: Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Literatur im Internet:
www.aerzteblatt.de/lit4719
oder über QR-Code

1.
Securpharm e.V. Deutsche Organisation für die Echtheitsprüfung von Arzneimitteln. https://www.securpharm.de/.
2.
Petry R, Schmitt M, Popp J: Raman spec-troscopy – a prospective tool in the life sciences. Chemphyschem 2003; 4 (1): 14–30 CrossRef MEDLINE
3.
Europäisches Arzneibuch (Ph. Eur.), Grundwerk 9.0, Amtliche deutsche Ausgabe: 2.2.48: Raman-Spektroskopie. Stuttgart: Deutscher Apotheker-Verlag 2017; 118–21.
4.
De Beer TR, Baeyens WR, Ouyang J, Vervaet C, Remon JP: Raman spectroscopy as a process analytical technology tool for the understanding and the quantitative in-line monitoring of the homogenization process of a pharmaceutical suspension. Analyst 2006; 131: 1137–44 CrossRef MEDLINE
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6.
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12.
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13.
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Raman-Spektren der untersuchten DTaP-Impfstoffe
Raman-Spektren der untersuchten DTaP-Impfstoffe
Grafik
Raman-Spektren der untersuchten DTaP-Impfstoffe
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Naturfreund
am Dienstag, 26. November 2019, 17:02

Gefakte Impfstoffe

mehr ein Grund, von Impfungen abzusehen.